干细胞培养实验室简介

干细胞培养实验室简介（通用8篇）

干细胞培养实验室简介 篇1

培养基的配置：基础培养基500ml+胎牛血清50ml+双抗5ml 冻存液的配置：10 % DMSO + 90%胎牛血清 依次比例酌量配置。超净工作台常规配置

移液器1套（2.5μl、20μl、200μl、1ml），酒精灯1盏，液器1台，斜架1台，酒精喷壶1个，酒精棉球缸1个，污缸1个，常规耗材：培养瓶（50㎝2），定量移液管（5ml、10ml），枪头（1ml、200μl、10μl），培养皿，6/24/48/96孔板，医用脱脂棉球，冻存管 所需试剂：培养基，胎牛血清，双抗，DMSO，胰酶，75%酒精……

实验前准备：所需的各项高压后的耗材及污物缸放于超净工作台内，用酒精喷壶喷洒实验台面，并关闭工作台打开紫外灯照射30min后开始实验操作。培养基及胰酶恢复常温后使用，可37℃水浴5-10min

二、细胞复苏 步骤：

1.紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。

2.培养液（DMEM），恒温水浴箱37℃预热20min，备用。超净台内准备一支15ml离心管备用。

3.将所需的培养基确保瓶身干净后酒精消毒放于工作台面内，点燃酒精灯，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后需再次分别消毒瓶口和瓶盖。4.从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入37℃水浴中，快速摇晃，直至冻存液融化至黄豆粒大小后迅速取出。

5.将细胞悬液移入15ml离心管，缓慢加入4ml培养液，离心（1000r/min，5min）。6.取出2个培养皿并做好标记（复苏日期等），提前加入5-10ml培养液；离心结束后用1ml培养液悬液混悬沉淀细胞后分别加入培养皿内。

7.将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。8.将培养瓶放入培养箱内培养

注意事项：

1.取细胞的过程中注意带好防冻手套。此项尤为重要，细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。

2.冻存液的问题：冻存液的配置已是常识，在这里不作详述，但二甲基亚砜（DMSO）对细胞不是完全无毒副作用，在常温下，二甲基亚砜对细胞的毒副作用较大，因此，必须在1-2min内使冻存液完全融化。如果复苏温度太慢，会造成细胞的损伤，二甲基亚砜（DMSO）最好选择进口产品。

3.离心前须加入少量培养液。细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高，注意加入少量培养液可稀释其浓度，以减少对细胞的损伤。

4.离心问题：目前主要有两种见解。一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养，第二天换液。因为离心的目的是两个，去除 DMSO，去除死细胞，这个是标准流程，但对一般人来说，把握不好离心转速和时间，转的不够活细胞沉底的少，细胞就全被扔掉了，转过了活细胞会受压过大，死亡。此外在操作过程中容易污染，所以不推荐。另一种说法为细胞悬液中含有二甲基亚砜（DMSO），DMSO对细胞有一定的毒副作用，所以须将离心后的液体前倒净，且一定倒干净。

5.冻存细胞解冻时1ml细胞液要加10ml－15m培养液

6.复苏细胞分装的问题：复苏1管细胞一般可分装到2-3只培养皿中，分装过多，细胞浓度过低，不利于细胞的贴壁。

7.加培养基的量放入问题：这个量的多少的把握主要涉及到的问题是DMSO的浓度，从如果你加培养基的太少，那么DMSO的浓度就会比较大，就会影响细胞生长，从以前的资料来看，DMSO的浓度在小于0.5%的时候对一般细胞没有什么影响，还有一个说法是1％。所以如果你的冻存液的浓度是 10％DMSO的话那么加10ml以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度

8.原理：在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的－5～0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。

三、培养液的更换

1.紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。

2.培养液（DMEM），恒温水浴箱37℃预热20min，备用。

3.将所需的培养基确保瓶身干净后酒精消毒放于工作台面内，点燃酒精灯，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖。4.将培养皿盖内口朝上放在架子上，将培养皿内的培养液悬空倒进污缸 5．拿出1支高压后的5ml定量移液管，在酒精灯上灼烧尾部后装于移液器上，再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3次，悬空进入培养基瓶内吸取5-10ml培养基再悬空移入培养皿内，将培养皿盖在酒精灯上消毒2-3次后盖上。6.将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。7.将培养瓶放入培养箱内培养

每天定时观察细胞生长情况，一般72-96h后，细胞生长密度大于90%，即可进行细胞的传代。

四、细胞传代

1.紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。

2.培养液，胰酶，恒温水浴箱37℃预热20min，备用。

3.将所需的培养基，胰酶确保瓶身干净消毒后放于工作台面内，点燃酒精灯，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。

4.将培养皿盖内口朝上放在架子上，将培养皿内的培养液悬空倒进污缸。取1ml移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2次，然后再装上枪头吸取1-2ml胰酶液，悬空沿皿壁加入培养皿内。

5.将培养皿来回倾倒使胰酶浸没整个皿底的细胞层，计时越1-3min（消化时间根据细胞不同时间不同），对着灯光可观察到细胞与细胞之间有针孔样缝隙，并有1-2个细胞脱落，镜下观察到细胞都变圆时为胰酶消化的最适时机。（若看到成片的细胞从瓶壁脱落为胰酶消化过度；若看不到针孔样缝隙和细胞脱落，或镜下细胞多有菱角则需继续消化）。用移液器将胰酶吸净。

6.吸取1ml培养基于培养皿内，并用移液器吸取少量的培养基轻柔的反复冲洗培养瓶壁5-8次，使贴壁细胞完全脱落于培养基内再轻轻吹打2-3次，使细胞尽可能处于单个悬浮状态。

7.取1或2个新的培养皿，然后将细胞培养基均匀的分到2或3个培养瓶内（注意原来传代时使用的培养瓶可继续传代使用），进行1传2或1传3的培养。8.拿出1支高压后的5ml定量移液管，在酒精灯上灼烧尾部后装于移液器上，再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3次，悬空进入培养基皿内吸取5-10ml培养基悬空移入每个培养皿内，将培养皿盖在酒精灯上消毒2-3次盖上，在皿盖上做好实验标记。

9.将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。

10.将培养瓶放入培养箱内培养。注意整个培养箱底托盘内一定要放高压后的水，且定期更换确保无菌。

每天定时观察细胞生长情况，一般72-96h后，细胞生长密度大于90%，即可进行细胞的传代或保株。

五、细胞株的保存

原理：细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。如细胞脱水使局部电解质浓度增高，pH值改变，部分蛋白质由于上述原因而变性，引起细胞内部空间结构紊乱，溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶，使细胞内结构成分造成破坏，线粒体肿胀，功能丢失，并造成能量代谢障碍。胞膜上的类脂蛋白复合体也易破坏引起细胞膜通透性的改变，使细胞内容物丢失。如果细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。因此，细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外，减少胞内形成冰结晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。

实验步骤：

选择处于对数生长期的细胞，在冻存前一天最好换液。将多个培养瓶中的细胞培养液去掉，用0.25% 胰蛋白酶消化。适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。悬浮生产细胞则不要消化处理。然后将细胞收集于离心管中离心(1000r/min，10分钟)。加入冻存管中，再加入1ml配置好的冻存液后放入梯度降温盒，放入-80℃冰箱中。

1.紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。

2.培养液，胰酶，二甲基亚砜DMSO，胎牛血清（解冻），梯度降温盒恢复常温，恒温水浴箱37℃预热20min，备用。

3.将所需的培养基，胰酶确保瓶身干净消毒后放于工作台面内，点燃酒精灯，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。

4.将培养瓶瓶口在酒精灯上消毒2-3次，旋开后分别再次消毒瓶口和瓶盖2-3次，盖放于酒精灯右侧后将培养瓶内的培养液悬空倒进污缸，在酒精灯消毒2-3次瓶口，竖直放好。取1ml移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2次，然后再装上枪头吸取1.5ml胰酶液，悬空移入培养瓶内。

5.将培养皿盖内口朝上放在架子上，将培养皿内的培养液悬空倒进污缸。取1ml移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2次，然后再装上枪头吸取1-2ml胰酶液，悬空沿皿壁加入培养皿内。6.将培养皿来回倾倒使胰酶浸没整个皿底的细胞层，计时越1-3min（消化时间根据细胞不同时间不同），对着灯光可观察到细胞与细胞之间有针孔样缝隙，并有1-2个细胞脱落，镜下观察到细胞都变圆时为胰酶消化的最适时机。（若看到成片的细胞从瓶壁脱落为胰酶消化过度；若看不到针孔样缝隙和细胞脱落，或镜下细胞多有菱角则需继续消化）。用移液器将胰酶吸净。

6.吸取1ml培养基于培养皿，并用移液器吸取少量的培养基轻柔的反复冲洗培养瓶壁5-8次，使贴壁细胞完全脱落于培养基内再轻轻吹打2-3次，使细胞尽可能处于单个悬浮状态。

7.将悬浮细胞吸入15ml离心管内，加入4ml培养基离心1000r/min，5min 8.预先配制冻存液：10 % DMSO + 90%胎牛血清。按需要配置一定数量备用 9.弃去培养基，用冻存液进行重悬混匀后，将1ml含有细胞的冻存液移入冻存管内，拧紧瓶盖，做好实验标记。

10.将培养基，胰酶瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。

8.将冻存管先放于4℃冰箱 30min后拿出放置-20℃冰箱过夜，次日再放于-80℃的冰箱内3-4天，最后存放于-196℃的液氮灌内长期保存。或直接放入梯度降温盒内，放入-80℃冰箱内过夜后最后存放于液氮罐内。（梯度降温盒内为甲醇，使用5次需要更换，每次使用需做好标记，使用前需恢复常温）

六、细胞转染

RNA干扰（RNA interference, RNAi）:  是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。基因沉默，主要有转录前水平的基因沉默(TGS)和转录后水平的基因沉默(PTGS)两类:TGS是指由于DNA修饰或染色体异染色质化等原因使基因不能正常录;

 PTGS是启动了细胞质内靶mRNA序列特异性的降解机制。有时转基因会同时导致TGS和PTGS。

 由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，（长度超过三十的dsRNA会引起干扰素毒性）所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗领域。

 病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应。

作用机制

1)其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA（大约21～23 bp），即siRNA。

2)siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶（包括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC)。

3)RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。

4)siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。

5)RNAi发生于除原核生物以外的所有真核生物细胞内。需要说明的是，由于dsRNA抑制基因表达具有潜在高效性，任何导致正常机体dsRNA形成的情况都会引起不需要的相应基因沉寂。所以正常机体内各种基因有效表达有一套严密防止dsRNA形成的机制。

脂质体转染原理：

1.脂质体是磷脂分散在水中时形成的脂质双分子层，又称为人工生物膜。最初，人们只是运用脂质体模拟生物膜，研究膜的构造及功能，从而发现了膜的融合及内吞作用，因而可用作外源物质进入细胞的载体 2.阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用将DNA分子包裹人内，形成DNA一脂复合体，也能被表面带负电荷的细胞膜吸附，再通过膜的融合或细胞的内吞作用，偶尔也通过直接渗透作用，将DNA传递进入细胞，形成包涵体或进入溶酶体其中一小部分DNA能从包涵体内释放，并进入细胞质中，再进一步进入核内转录、表达

DNA转染步骤

1.转染前一天接种细胞于6孔板，0.5-2×105每孔，2ml无抗生素培养基每孔，第二天转染时细胞达到90-95%每孔。

2.转染前半小时换Opti-MEM无血清培养基1.5ml。

3.A液：DNA 5ug 加入245ul Opti-MEM无血清培养基，轻轻混匀。

4.B液：脂质体使用前轻轻混匀，脂质体10ul 加入245ul Opti-MEM无血清培养基，轻轻混匀，室温静止5min。

5.B液加入A液，用枪轻轻混匀，室温静止20min。

6.将混合液均匀分散慢慢滴加到6孔板细胞中，边滴加变前后左右十字交叉摇晃。

7.孵箱37℃培养48h（转染时间待定）。8.第二天看细胞状态来决定是否换液。9.同时设立细胞对照组，空白转染组。

siRNA转染步骤

1)转染前一天接种细胞于6孔板（40x104），2ml无抗生素培养基每孔，第二天转染时细胞达到50-60%每孔。

2)转染前半小时换Opti-MEM无血清培养基1.5ml。

3)A液：siRNA 5ul（共100pmol）加入245ul Opti-MEM无血清培养基，轻轻混匀。（siRNA按照说明书稀释）4)B液：脂质体（RNAimax）使用前轻轻混匀，脂质体10ul 加入245ul Opti-MEM无血清培养基，轻轻混匀，室温静止5min。

5)B液加入A液，用枪轻轻混匀，室温静止20min。

6)将混合液均匀分散慢慢滴加到6孔板细胞中，边滴加变前后左右十字交叉摇晃。

7)孵箱37℃培养48h（转染时间待定）。8)第二天看细胞状态来决定是否换液。9)同时设立细胞对照组，空白转染组。

使用RNAiMAX和AGS cell用于siRNA在6孔板上进行转染实验

1)提前配制GAPDH，NC，NV-FAM及各片段siRNA的20uM的稀释液，取附赠的DEPC水至管内，打开离心管前先离心，将附在管壁上的冻干粉离心下来 2)溶解时滴加适量的DEPC水后盖上管盖，震荡溶解：NC，NC-FAM溶解加入62.5ulDEPC水，其他siRNA片段加入125ul DEPC水

3)取6只EP管，分别标记GAPDH，NC，NV-FAM，三个片段名称，从管内吸取20ul的稀释液分装后

4)将稀释液至于-80度冰箱保存。

 转染前一天，在6孔板上接种40x104AGS cell，再取一个35mm培养皿接种40x104AGS cell，每孔放2ml不含抗生素的生长培养基。使细胞在转染的时候有50-60%的融合率

 从细胞中除去生长培养基

 每个孔中加入1.5ml新鲜不含血清的培养基，并准备如下混合物 1)A液：(取7个EP管，分别标记空白，GAPDH，NC,NC-FAM,三个片段)。在250ul的opti-mem终加入100pmol siRNA（稀释好的siRNA浓度为20uM，100pmol的siRNA需要取5ul），混合均匀

干细胞培养实验室简介 篇2

1 材料与方法

1.1 材料及仪器

新西兰大白兔(福建医科大学动物实验中心提供);DMEM培养基(Gibco公司);胎牛血清(Hyclon公司);0.25%胰酶加ED TA(Gibco公司);Percoll分离液(Sigma公司);倒置显微镜(Olympus);CO2孵箱(Thermo Forma311,美国);超净工作台(DCM-1300,苏州);自动台式离心机(LD25-2,北京);细胞培养板、培养瓶(Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 兔MSC的分离与培养

新西兰大白兔,6周龄,体重约1.5 kg,雌雄不限。3%戊巴比妥钠静脉麻醉,于无菌条件下在双侧坐骨棘处用18号骨髓穿刺针接5 ml注射器,内含肝素钠0.2 ml(100 U/ml),各抽吸骨髓液2 ml,抽吸完毕迅速将注射器内液体均匀混合,注入培养皿,用1 ml注射器反复吹打培养皿中的骨髓液约5 min,置入离心管,1000 r/min离心10 min,弃去脂肪和上清,用PBS重悬制成细胞悬液,小心加入至2倍体积1.073 g/ml的Percoll分离液上层,室温下以2000 r/min离心25 min。收集中间乳白色的有核细胞层,再用PBS洗涤2次,加入适量的含双抗的20%胎牛血清DMEM培养液吹打制成细胞悬液,置于离心管中,1000 r/min离心15 min。弃上清液,加入3 ml含双抗的20%胎牛血清DMEM培养液,反复吹打,稀释成细胞悬液,以1.0×104/cm2接种于50 cm2培养瓶中。于37℃、体积分数为0.05的CO2、饱和湿度的培养箱中培养,3 d后首次半量换液,将未贴壁的细胞全部弃掉,以后每2～3天全量换液1次。待细胞汇合成单层后,用0.25%胰蛋白酶消化,得到原代MSC悬液,再以1.0×104/cm2传代培养。

1.2.2 细胞生长观察

每天在倒置显微镜下观察细胞的生长情况及形态特征,并适时拍照。

1.2.3 绘制细胞生长曲线

取生长良好的第3代细胞消化成单细胞悬液,计数,以1.0×104个/ml接种于24孔培养板,将板上的细胞随机分成12组,每组3孔,每孔接种1 ml,培养孔内加入等量培养液,同一条件下进行培养,每天取出3孔细胞,0.25%胰酶消化,连续测12 d,计算每孔中的细胞数,取平均值。以时间为横坐标,细胞数为纵坐标,绘制生长曲线。

1.2.4 MSC贴壁率测定

取第3代MSC,制备成单细胞悬液,1.0×104个/ml接种于8个25 cm2培养瓶,每瓶3 ml。每2小时取出1瓶倒掉未贴壁的细胞,0.25%胰蛋白酶消化贴壁的细胞并计数,计算各个时间点的贴壁率。贴壁率(%)=(已贴壁细胞数/接种细胞总数)×100%。绘制贴壁率曲线。

2 结果

2.1 MSC的生长情况及形态学特点

骨髓细胞经密度梯度离心后,接种于50 cm2培养瓶中,倒置显微镜下观察培养液中存在大量大小不一的圆形细胞;24 h后可见多数贴壁的圆形细胞中散在少数多角形或短梭形细胞,有数个突起类似成纤维细胞;3～4 d后梭形细胞和多角形细胞显著增多;5～6 d后形成细胞集落方式生长,数量明显增多,呈现长梭形、纺锤形,细胞轮廓清晰,排列较紧密;7～9 d后,细胞生长明显加速,逐步形成大小不一、分散的细胞集落,呈放射状向四周扩展,细胞呈漩涡状或平行排列;第10～12天,贴壁单层生长的细胞铺满整个培养瓶底,放射状或漩涡状生长方式更趋明显,非贴壁细胞通过换液已逐渐被清除,基本完成原代单层生长。传代细胞的细胞贴壁时间和增殖速度比原代培养要快,大约2 h开始贴壁,培养8～11 d互相接触形成单层。传代细胞分裂象多见,胞体大,细胞边界不清楚,胞质内颗粒多,显示细胞功能活跃,处于活跃的基质合成状态。传代至第10代后,细胞增殖速度减慢,细胞形态出现多样性,逐渐呈老化现象。见图1～3。

2.2 MSC生长曲线

从第3代细胞的生长曲线图(图4)可以看出,1～3 d细胞增殖缓慢,为潜伏期;4～6 d,细胞增殖开始活跃,进入对数生长期,此期细胞生长迅速;7～9 d细胞达到顶点后进入平台期。

2.3 MSC的贴壁率

第3代MSC的贴壁率(图5)表明细胞贴壁较快,2 h贴壁率达30%以上,6 h贴壁率达60%以上,14 h贴壁率达90%以上。

3 讨论

MSC最初是一类易于贴附于培养板表面的成纤维细胞样细胞,它具有以下特点:(1)取材方便且对机体无害;(2)由它诱导而来的组织在进行移植时不存在组织配型及免疫排斥的问题;(3)它可以向多种组织类型分化,在体外可大量培养扩增;(4)转入外源性基因后不影响MSC的特性[5]。因此,MSC目前已成为组织工程种子细胞的首选[6,7,8]。MSC占骨髓有核细胞的比例很小,只有1/10万[9],难以满足细胞工程的需要。因此,将体内骨髓的MSC在离体条件下进行分离纯化,并进行体外扩增就显得尤为重要。

本实验使用密度为1.073 g/ml Percoll分离液作为分离液,用密度梯度离心法分离培养MSC取得较好的效果。24 h内即有较多细胞开始贴壁变形,而且细胞的形态、大小非常一致。3 d后首次半量换液,经多次换液,去除大量不贴壁的杂细胞。原代培养的细胞一般10～12 d铺满整个培养瓶底,呈放射状或漩涡状;而传代培养细胞的生长速度更快,每代8～11 d即可铺满整个培养瓶底;扩增1代及2代后MSC的纯度分别达95%和98%[10];10代以前的细胞都能保持快速的增长;传代后所获得的MSC细胞形态均一,增殖速度快,生长性状稳定,细胞为均一的成纤维样细胞,具有MSC的一般特性[11,12]。

兔MSC的体外培养经历了潜伏期、对数生长期和平台期三个时期。通过本实验,笔者发现第3代MSC已经基本纯化,生长曲线为S形曲线,其生长、贴壁能力均较好。第1～3天为潜伏期,细胞数量无明显增多。第4～6天为对数生长期,从第4天起细胞开始增殖,第6天左右细胞生长达顶点,到第9天时细胞数量有所减少。以后进入平台期,传代周期约为8 d,每传代一次细胞增加2～3倍,传代后4 h便可有半数以上的细胞贴壁,说明MSC增殖及分裂能力十分活跃,并且细胞的贴壁时间短,贴壁细胞的存活率高,细胞的适应生存能力较强,体外扩增容易,有巨大的扩增潜能。

总之,本实验所使用的分离和培养兔骨髓MSC的方法操作简便,成本低廉,分离和培养的细胞增殖力强,能在短期内获得高纯度的MSC,可以作为骨组织工程的种子细胞,为组织工程骨的构建提供依据。

摘要：目的:研究兔骨髓基质干细胞(MSC)的体外分离、培养和增殖,探讨其生物学特性。方法:自兔髂骨抽取骨髓,采用密度梯度离心法分离纯化MSC,并培养、增殖。观察MSC的生长情况及形态学特点,绘制细胞生长曲线,同时计算贴壁率。结果:体外培养的兔MSC贴壁生长,呈长梭形,可增殖形成克隆;生长曲线为典型的S形曲线;MSC的贴壁率高,第3代培养14h贴壁率达90%以上。结论:用密度梯度离心法分离MSC是可行的。分离获得的MSC体外培养显示,MSC生长稳定,增殖速度快。MSC将是骨组织工程理想的种子细胞。

干细胞培养实验室简介 篇3

关键词：细胞生物学、实验教学、创新能力培养

【中图分类号】G642

基金项目：国家基础科学人才培养基金项目(J1103507)

随着生命科学的不断进步，人们对细胞的研究不断深入。细胞生物学已成为当前各个高校生命科学相关专业的主干课程之一。细胞生物学作为一门实验科学，在本科教学中具有举足轻重的地位[1]。细胞生物学实验课程的开设，是以学生掌握基本实验技能和有关细胞生物学的研究方法为目的，并通过实验培养学生的创新能力和科研意识，从而达到提高学生综合科研素质的目的。

目前细胞生物学实验教学仍存在着一些不足与缺陷。诸如教学方法过于简单、教学内容不能体现最新研究成果、教学评价有待进一步科学化和规范化所导致的实验教学效果不佳和效率低等问题。这些都影响了学生创新能力的培养和科研素质的提高，不利于学生将来的综合发展。培养具有一流科研素质和创新能力的复合型人才, 是广大教育工作者面临的巨大挑战。在当前的学习中, 学生注重理论学习轻视实验学习思想还很严重；教师队伍中, 存在着重科研轻教学特别是基础实验教学的现象, 这在很大程度上忽视了对本科生动手能力和科研创新能力的培养。实验教学的水平和装备条件差异较大的问题依然存在。为提高细胞生物学实验教学质量, 全面培养学生的创新能力, 我们在细胞生物学实验教学过程中更加注重学生创新能力的培养环节，对实验教学进行了初步改革探索。

1优化实验教学内容，体现时代性

(1)优化细胞生物学实验教材

作为一门独立开设的课程，细胞生物学实验课在于培养学生的实验动手能力、创新能力，提高学生的科研素养。随着教学改革的不断加快和教学设施的不断完善，陈旧的实验教学内容和单一乏味的验证性实验过程已不能满足现阶段的实验教学要求[2]。优化细胞生物学实验内容，体现本领域最新研究成果并增强实验教学的时代性，是目前一项重要的工作。首先要选取兄弟院校的优秀实验教材用书。我们学院选用的是有高等教育出版社和施普林格（Springer）出版社联合出版，李素文主编的《细胞生物学实验指导》。其次专业实验课教师可根据多年细胞生物学实验教学的经验和学院特色编写制作更合适的实验课教材及与之配套的课件。细胞生物学实验教学内容的选取一是应依据精炼、新颖、灵活的思路，二是要根据现有的实验基础条件，充分利用共享公共资源平台，增设开放性，研究性实验项目。让学生通过实验课教学能更好的巩固理论知识，用理论知识支撑实践教学。

(2)及时更新实验内容，完善培养模式

科技发展永不止步，细胞生物学领域的新概念、新信息、新理论也是层出不穷。细胞生物学实验教学要能及时跟踪国际上细胞生物学研究进展及热点并在实验内容上有所体现。通过对最新研究成果的评述，让学生结合已学习过的理论知识开启发散性思维。首先我们不断尝试结合细胞生物学的最新进展，在原有课程的基础上，增设研究型实验课题。比如开展了C2C12细胞的传代培养及活性检测实验，在此基础上我们选取了一些细胞炎性因子让学生自己设计实验去研究细胞的增值和迁移现象。另外还采取本科生导师制，由学生根据自己的兴趣自由选择细胞生物学方面的教师作为导师，进入到专业实验室结合导师的科研课题进行探究性实验。这些举措不仅让学生在极有限的时间内学到了基础性实验技术，而且在综合性实验阶段进一步促进了学生的三种能力培养（创新能力、实践动手能力和团队合作能力），极大地激发了学生对细胞生物学实验的兴趣。

2建立以学生为主体的实验教学方法

(1)讨论启发式教学

诱发学生学习动机、激发其学习兴趣，对于细胞生物学实验教学至关重要。目前很多学校的实验教学方法依旧是采用“灌输式”方法教授学生，学生在教学过程中只是被动的、按部就班的进行实验,缺少主动思考的时间和空间。这种教学方法不仅禁锢了学生的创新思维，更加泯灭了学生对实验的兴趣。细胞生物学实验教学方法的好坏直接影响着教学目标的实现和教学内容的确立。我们利用有限的课时开展讨论启发式教学方法，并结合利用现代化教学手段，结合音频，视频等材料辅助教学，充分调动学生学习的积极性；基于细胞生物学教学实验室和科研实验室的设施条件，选取实验主题，实施开放式教学，让学生积极主动参与实验教学过程中，变被动为主动，充分建立以学生为主体的实验教学方法。在学生参与实验的过程中，对学生进行自由分组，每组4人左右，根据选中的课题，鼓励学生充分利用图书馆资源、数据库资源查找相关文献，最终提交实验项目小论文，并作为主角在课堂上进行讲解展示，同时回答老师和同学们的提问。通过这种讨论启发式的教学，极大拓展了学生的创新思维。

(2)现代化多媒体教学手段辅助

多媒体教学直观生动，有利于学生对知识的理解和掌握，激发学生的兴趣，提高教学效果。细胞生物学实验教学内容中，有不少具有一定的复杂性和抽象性，仅依靠传统的教学方法已经无法满足学生们的需要，多媒体技术的应用能将一些原本口述或板书困难的抽象概念具体、直观地显示出来，使学生对要学习的实验课有更加整体直观的印象。比如我们在进行细胞培养实验课的教学过程中，就安排参加教育实习的研究生按照实验流程进行相关的实验操作，同时用录像机记录下相关视频配上解说制作成视频文件，在做细胞培养实验前给同学们放映。让同学们通过观看录像，对实验的前期准备工作和实验过程中的要点难点进行学习，这样可以有效地提高学生的实验技能和成功率，并且同学们在观看的过程中还可以进一步巩固自己学过的理论知识，进而提出关于实验的疑惑之处。通过在实验教学过程中适当的运用多种教学手段，使学生对实验原理、实验过程、实验结果等理解的更加透彻，让学生能够充分发挥他们的想象力、创新性和主动性。

3构建多层次实验成绩综合评定模式

(1)设置开放式实验

实验开放包括实验材料的开放，实验内容的开放和实验室的开放[3-4]。由于目前本校细胞生物学实验主要是面向大三本科生开设，他们在本学期的课程任务较重，时间有限。所以灵活开展一些开放性实验，充分利用他们的空余时间对培养他们的创新能力非常必要。比如我们在开展细胞核的荧光显微镜观察实验中，就设置了不同染色原理的荧光染料，让同学们自由选择，根据荧光染料的选择，自己动手设置荧光显微镜的激发滤光片，通过规范操作，得出结果并形成实验报告。这样，选择不同染料的同学得到的结果就不相同，避免了有些同学在写实验报告过程中的相互借鉴现象，同时在此过程中也激发了同学们的创新思维能力。

(2)实验报告更注重对结果的分析

生物学是一门实验科学，有实验就要允许失败。我们细胞生物学实验教学过程中并非要求所有学生一定要得到预设的实验结果。我们的实验课允许没有实验结果的实验报告上交，前提是学生要根据我们的实验步骤，回忆自己实验过程中的操作，找出实验失败的原因并进行分析。我们认为这样的实验报告，虽没有实验结果，但锻炼了学生的分析能力，同时在另一方面培养了创新能力。

(3)成绩评价多样化

细胞生物学实验课的成绩要体现出评价多样化。仅仅根据平时的实验报告已不能全面反映学生在实验课上的表现，更不能全面体现学生的创新能力和科学素养。我们的成绩评价是以平时的实验报告为基础，还包括平时考评（出勤率和课堂表现），操作性强的实验课的操作成绩，以及期末考试成绩。为考察学生分析解决问题的能力，我们在期末笔试中还加入了一定比例的实验设计题和综合性分析题。这些题目让学生更注重知识的综合应用，非常有利于学生综合素质的提高。通过多样化的成绩评定模式既提高了学生学习的主动性，夯实了基础实验知识，又促使学生更重视平时的实验操作训练，提高自己的实验技能和综合素质，从多方面培养其创新能力。

随着细胞生物学学科的迅猛发展，细胞生物学实验教学的改革探索必须跟上。细胞生物学实验教学的改革，能进一步提高学生的实验专业技能，增强其团队合作意识，同时培养学生的创新能力。

主要参考文献：

[1] 孙剑华，张红锋。2010. 基于学生发展的细胞生物学实验评价．实验室研究与探索， (3):127～129.

[2] 娄慧玲，郭滨，吴燕华，等。2011. 细胞生物学实验教学的探索与实践. 高校生物学教学研究（电子版），(1):44.

[3] 梁桂英，王春晓。2007. 开放实验教学提高学生创新能力. 高师理科学刊，(1):91～93.

干细胞培养实验室简介 篇4

优化分离及培养骨髓间充质类成纤维样集落细胞的实验研究

[目的]探讨分离培养骨髓间充质类成纤维样集落细胞的最佳条件,并观察其生物学活性.[方法]采用优化分离方法,常规细胞培养、传代技术,光镜技术及细胞增殖活性检测法,观察不同浓度血清、不同接种密度对骨髓间充质类成纤维样集落细胞生长、增殖、形态及集落形成率的`影响,观察培养细胞的生物学特性并将该类细胞向成骨细胞诱导分化.[结果]以差速贴壁法,加入10%进口胎牛血清、接种密度为5×104个/ml的培养条件为最适宜细胞生长;在此条件下,具有快速增殖的能力及较高的集落形成率;光镜下细胞呈梭状或类成纤维状,2～8代的细胞呈均质状;诱导后的成骨细胞AKP检测成阳性.[结论]明确了骨髓间充质类成纤维样集落细胞培养所需的细胞接种密度,血清培养浓度,该类细胞具有干细胞特性,为进一步深入研究该类细胞的应用打下了基础.

作 者：张璇 林春博 杨渊 谢富荣  作者单位：张璇,杨渊,谢富荣(广西骨伤医院,广西,南宁,530012)

林春博(广西中医学院,广西,南宁,530001)

刊 名：广西中医学院学报 英文刊名：JOURNAL OF GUANGXI TRADITIONAL CHINESE MEDICAL UNIVERSITY 年，卷(期)： 12(4) 分类号：Q25 关键词：优化分离   优化培养   骨髓间充质类成纤维样集落细胞  

物理实验室简介 篇5

物理实验室简介

我校物理实验室分实验室和准备室两室，其中实验室面积88m2,准备室45m2，实验桌12张，仪器柜10个，仪器共6类，120种，2560件，仪器按使用范围分为通用，测量，专用模型，玻璃器皿及其它实验材料和工具等。

实验室备有固定资产明细账并建立健全防火防盗措施，制定学生实验守则、仪器使用制度。确保试验过程的安全有效，所有仪器完好率可达95%。学校为了学生更好的学好物理课，还成立了“物理兴趣小组”为学生提供更多的机会。让他们通过自己观察，自己动手，亲历实验，加深对所学知识的认识和理解，激发学生爱科学、学科学的兴趣和强烈的求知欲，能够充分开展演示实验和分组实验，完成率达100%，并且下午时间对学生开放，让学生有更多的机会到实验室学习和探究。

生物实验室简介 篇6

下 坝 中 学

2013年11月11日

生物实验室介绍

根据我校的实际情况，我校生物试验室材料有以下几点：

一、实验仪器保管室、实验室、教学及实验仪器（药品）达标情况： 1.我校现有生物实验室1个，面积48m2，实验室的水电到位，完全满足实验仪器的存放、保管和实验准备之用。

2.保管室1个，面积48m2。实验操作台按照标准一类学校配备，共配座位 48个。完全满足全校学生12个分组实验的需求。3．各种教学仪器（药品）配备品种、数量达标情况：

品种达431种，数量有5431件，价值达130586元。其中2013年新增2495种，新增部分的价值为62107元，完全能满足生物学科演示和分组实验需求。仪器按使用范围分为：通用、测量、专用、模型、标本、挂图、玻璃仪器、药品及其他试验材料和工具。

二、实验室、仪器室管理情况：

1、专人管理。所有仪器完好，保证紧密配合教学工作。服务教学一线，结合新课程要求，开足开齐演示实验、学生实验和探究性实验，无论分组实验还是演示实验，只要能做的，都让学生观察和实际操作。

2、制度化管理：有完善的管理规章制度，建有仪器借还、实验预约登记、仪器损坏报废登记等制度，各实验室、仪器室有相应的使用规则，实验室工作以教学为中心，以提高教学质量为目的，加强实验教学环节。并积极创造条件向学生开放实验室，在教师和实验人员的指导下开展课外科技活动。

3、明细化管理：仪器室的仪器建有总帐、分类帐，各室建有明细帐，并做到柜有柜卡，物有标签，仪器存放整齐、规范，对部分仪器定期维修，保证正常使用，坚持做到期初有计划、期末有总结，各项制度、实验员工作职责都张贴在墙上，以便经常对照学习。实验的周计划，每学期初就公布上墙，做到合理安排，一周工作早知道。学生进入实验室必须遵守学生实验规则，实验结束要填好实验记录单。仪器损坏按有关制度赔偿。各室登记台帐，既有电子台账，又有纸质台账，做到帐、物、卡相符，并及时做好新增仪器的登记和仪器的报损工作。

4、安全管理：生物实验室备有灭火器 1个，建有防盗铁栏，危险药品按要求专柜存放实验室备有固定资产明细帐及安全防盗防火措施，并建立健全学生实验守则，仪器使用制度等，确保试验过程的安全有效。

三、实验教学完成情况：

学校教师按课程标准和教材的规定上好实验课，学校要求将实验课列入教学计划，加强检查，每学期都有统计的实验开出率。实验教师能配合任课教师指导学生完成实验，实验学生写有实验报告。

演示实验和分组实验完成情况：

七年级： 演示实验：应做

12（个）已做 10（个）完成率 83.3 %

分组实验：应做 18（个）已做 16（个）完成率 89% 八年级： 演示实验：应做（个）已做 7（个）完成率 100 %

分组实验：应做 12（个）已做 11（个）完成率 91.7%

四、实验教学及实验室工作亮点

1、我校住校生实行专人专业化管理，各实验室还对留守儿童组织课外活动，兴趣小组，让他们能够独立自主的学习，同时学校自发组织起全校师生对留守儿童的捐赠活动。

2、在学校管理方面，学校非常重视实验教学，今年暑假配备了新的实验仪器。能够充分开展演示实验和分组实验。

五、还需加强的地方：生物生科注重对学生的兴趣爱好、科学素养、实验操作能力，观察能力等的培养，为了能学城市学校缩小差距，学校假期好对实验室加强配备，但是由于我刚走进教师行业，理论上的知识没能更好的实践，学生管理，实践经验还很欠缺，需要更多的学习。

干细胞培养实验室简介 篇7

关键词：细胞生物学,实验教学,创新能力

实验教学是细胞生物学教学的重要组成部分, 它既是理论与实践相结合的教学过程, 又是课堂理论技术的继续补充和深化, 不仅担负着培养学生实验技能的任务, 而且在培养学生创新意识和创新能力方面同样发挥积极作用。长期的实践表明, 我校细胞生物学实验教学存在着内容剧增与实验学时缩减、验证性实验偏多而学生兴趣不浓等问题, 不利于学生创新能力培养。为了实现培养出符合生物科学和生物技术专业要求的、基础知识面宽、具备创新能力的人才, 我们在细胞生物学实验教学中在针对性地作了必要的探索和改革, 取得了良好的效果。

1 重新设置实验内容

要培养学生的创新能力, 更新实验内容是关键。据统计, 19世纪人类科学知识增长一倍需要用五十年时间;20世纪需用十年时间;而21世纪只需三至五年时间。在生命科学进入细胞科学的21世纪, 细胞生物学必然回答生命科学最重要、最基本问题的一门学科。紧跟时代的发展步伐, 按照素质教育的要求, 以培养创新能力为目的, 我们在细胞生物学教学实验内容上已作了相应改变, 由最初的实验中细胞及相关结构的形态结构观察为主的实验向细胞及相关结构功能研究为主的实验, 以此来拓展教学时空创造性地开展实验。

例如, 在基础性实验中, 将普通显微镜及其使用项目改为特殊显微镜及其使用, 学生既学会了普通复式光学显微镜的使用, 同时对特殊显微镜如暗视场显微镜、荧光显微镜、相差显微镜等构造及原理有初步了解, 待后期实验中用到相关显微镜时巩固前期的知识, 引发了学生学习的浓厚的兴趣, 通过实验使学生充分掌握了生命科学领域中相关仪器设备的使用。

又如, 在验证性实验中, 细胞膜的渗透性实验由细胞凝聚反应和细胞膜的渗透性两部分组成, 是把最初的两个实验合二为一, 使学生对细胞膜的特性充分了解, 既培养学生基本实验操作能力, 同时增加了实验内容的量, 学生能全面了解细胞膜的功能及相关构造。

引入综合性实验和开放性实验。由于综合性实验内容涉及本课程的综合知识或相关课程知识, 原理或操作比较复杂实验, 如实验项目细胞融合, 通过实验学生了解细胞融合的几种方法, 并掌握具中一种方法, 培养学生综合利用细胞融合的知识, 拓展了学生学习的空间;开放性实验该部分主要侧重学生装创新能力的培养, 这类实验对指导教师和学生的要求都很高, 实验内容如细胞培养, 通过实验学生了解实验细胞培养的全过程, 调动了学生学习的主动性和创造性。

在细胞生物学新的实验教学体系中设产了必做的基础与验证性实验项目, 选做综合性与开放性实验项目, 以满足不同层次同学的需求。这样的实验教学体系既体现了实验的基本功能, 同时体现了在实验中培养学生的综合和创新能力, 使创新能力的培养贯穿于整个实验教学的过程中。

2 探索实验教学方法改革

常规的细胞生物学实验教学方法是教师针对本次实验的原理、步骤作详细讲解, 然后学生按照实验参考书上安排的次序按部就班实施, 传统的实验课教学以教师为主, 学生处于被动学习的地位, 学生实验操作技术得到锻炼, 但自我思维没有得到很好的锻炼, 也很难提高学生创新能力。因此, 在实验教学改革中我们应用了启发式教学、现代化电教手段辅助教学、开放式教学使学生全面准确的认识实验。

实验教学时贯穿启发式教学是针对实验目的与原理明确实验项目, 由学生设计操作步骤并操作, 使学生脱离实验指导, 由被动操作变为主动思考, 大大提高学生实验设计及科研思维能力, 也培养了他们的创新能力。

由于细胞生物学的高速发展, 使得实验教学满足不了实验与理论接轨, 往往实验内容滞后于理论发展, 具中具有代表学科发展实验技术, 因其操作的严格性、技术性, 难以在本科生实验教学中开展。为了解决这一难题, 我院充分运用现代化电教手段辅助实验教学, 通过网络及购买细胞生物学实验光盘, 作为实验资料播放给学生看, 使学生了解细胞生物学发展前沿, 开拓了知识面。

开放式教学是实验教学中培养创新人才的有效途径。针对理论教学的进度, 我们提出一组有关细胞生物学的研究课题, 这些研究课题中部分是教师目前正在进行研究课题。学生可根据自己的兴趣加入到教师的研究课题中, 了解该课题的研究状况、研究方法、研究方案等, 在实验数据整理等过程都在教师的具体指导下由学生自主完成, 研究结果作为毕业论文形式。进行这样一个研究课题, 不仅培养了学生综合运用基础理论进行创新的能力, 同时也培养了从事科学研究的能力。

3 提升实验教学环境

为了加强学生创新能力的培养, 充分调动学生学习的主动性和创造性。实验室也应加强对实验教学设备的更新, 实验场所的改善。我校为了加强细胞生物学基础必修课程的实验教学, 将细胞生物学实验室的仪器设备进行了逐步的更新, 实验场所也有所提升, 分为准备室、学生实验室及研究室三部分, 同时与其它实验室共享普通显微镜室、荧光显微镜室及多媒体生物学实验室。特别注重多媒体生物学实验室的使用, 在教师的适当引导下, 学生可根据需要, 通过电脑进入网络获得相应的知识, 通过主动行为去解决问题。根据现有条件和设想, 这部分资源设备刚起步, 下一步准备建立细胞生物学实验相关内容网站, 进一步完善学科建设, 不断增强本科生解决问题能力和创造能力。

综上所述, 细胞生物学实验教学不仅能够加深对课堂理论知识的理解和记忆, 而且可培养学生观察能力、实践动手能力、分析问题解决问题的能力和创新意识。细胞生物学实验教学改革是一项长期而艰巨的系统工程, 紧紧围绕培养目标、学科发展要求、学生创新能力和素质的提高, 通过不断完善和更新实验教学内容、实验方法和实验手段, 不断地改革创新、实践探索和科学总结, 促进细胞生物学实验教学跨上新台阶, 培养出一批合格的生物技术应用型人才。

参考文献

[1]侯燕芝, 张海燕, 孙林, 等.跨学科综合性实验项目的设计与开发[J].首都医科大学学报 (社会科学版增刊) , 2008:110～112.

[2]刁立文.生物学实验教学方法改革探析[J].辽宁师专学报, 2005, 7 (4) :55～56.

巨幼红细胞性贫血实验室检查分析 篇8

【关键词】 贫血；MCV值；LDH；胆红素；叶酸；B12

doi：10.3969/j.issn.1004-7484（s）.2013.11.808 文章编号：1004-7484（2013）-11-6788-02

巨幼红细胞性贫血为临床常见的并发症，血象呈大细胞性贫血，致病主要原因为患者消化系统病变和膳食异常、饮食习惯等所致，血清叶酸和维生素、B12缺乏、DNH合成障碍。骨髓中粒、红、巨三系列细胞合成受阻，从而导致红细胞和白细胞及血小板的生产减少，经治疗后三系恢复较快。现对我院110例患者情况加以分析，以提高对实验室检查的认识。

1 资料与方法

1.1 方法 血液常规采用日本光电6318型血细胞分析仪及原装进口试剂，应用希森美康800型全自动生化仪，以LDH-L速率法检测乳酸脱氢酶（LDH），由上海长征提供生化试剂，采用钒酸盐氧化法检测总胆红素及直接胆红素，由上海科华试剂有限公司提供试剂，采用Axyem荧光偏振免疫发光仪及配套试剂检测叶酸、维生素B12含量。

1.2 对象 取我院2000.6——2012.6间收治的共110例患者，血常规检查、骨髓涂片及血清叶酸、维生素、B12检测诊断为巨幼红细胞性贫血。临床表现符合巨幼红细胞性贫血，补充叶酸、维生素B12后有效。

2 病因与诊断依据

2.1 病因 110例，经电子内窥镜检查确诊的慢性浅表性或萎缩性胃炎55例

、胃癌切除及术后放化疗15例、口腔溃疡10例、纳差20例、慢性肝、胆疾病15例、慢性肠炎10例。

2.2 外周血象 可表现单纯红系、红系并发粒系或巨核系同时减少，贫血程度：RBC均值：2.5×109/L、HB均值：75g/L、MCV均值：121fL、MCH均值：

30Pg、MCHC均值270g/L，其中轻度贫血6例、中度贫血51例、重度贫血3

例、极重度贫血3例，治疗后轻度贫血35例、中度贫血25例、重度贫血5例、正常45例，MCV在治疗前后比较差异有统计学意义（P<0.05）。

2.3 胆红素程度 无黄疸表现43例，黄疸67例，其中隐性黄疸33例，该类患者总胆红素均值28.32mmol/L，直接胆红素均值8.9mmol/L，此类患者LDH均值1701u/L，仅一例LDH不高；显性黄疸34例中，胆红素均值61.5mmol/L，直胆均值23.5mmol/L，LDH均值略有增高，均值1810u/L，均高于正常，LDH与TBil两者呈正相关，相关系数为0.83。在对100例健康体检人群中，总胆红素均值20.3mmol/L，超正常值6例，有5例有胆道疾病，1例血液浓缩结果偏高，两类人群比较有明显差异（P<0.05）。

2.4 乳酸脱氢酶水平 110例巨幼红细胞贫血患者LDH均值1310u/L，以高于正常值上限230u/L，为阳性。增高81例，阳性率74%，与100例健康体检人群LDH3%阳性率比较差异明显有统计学意义（P<0.05）。

2.5 叶酸及维生素B12水平 76例患者进行检测，34例未测，血清叶酸均值7.6ug/L，维生素均值98ng/L，两者均降低35例，维生素B12降低35例单纯叶酸降低4例，两者均正常2例。在100例健康人群中检测叶酸、B12均在正常值内，以上差异明显有统计学意义（P<0.05）。

3 讨 论

巨幼红细胞性贫血患者的周围血象：红细胞、血红蛋白均减少，但红细胞数量减少更明显，红细胞直方图峰值右移，基底部增宽，但治疗后红细胞直方图会趋于正常化，证明给予叶酸、B12治疗有效。骨髓造血恢复正常，而健康体检组无一例叶酸，B12缺乏现象，说明骨髓对叶酸及B12很敏感；巨幼性红细胞贫血患者血清LDH含量明显增高，胆红素略有偏高，在隐性黄疸时，其升高程度与有关文献基本吻合，而显性黄疸则略高，在我们工作中少数MA患者蔗糖溶血试验呈阳性说明由大细胞性贫血，红细胞脆性增高，红细胞寿命缩短，细胞膜破裂，血红蛋白溢出的病理现象，说明溶血客观存在，而溶血最终导致LDH活性升高和黄疸的出现，但其不同于溶血性贫血，红细胞直方图，叶酸，维生素B12水平检查可区别。观察发现随着治疗的进行，LDH活性会逐渐降至正常水平。15%的巨幼红细胞性贫血患者的脾脏肿大，可能系慢性溶血所致，而骨髓增生异常综合症时，红细胞系也可表现巨幼样，但为病态造血，临床肝、脾、淋巴结肿大和发热，故应注意与MDS鉴别诊断，对贫血患者进行以上实验室检查，可明显提高MA的检出率，以防误诊。

参考文献

[1] 张之南，沈悌，主编.血液病诊断及疗效标准.第2版.北京：科学出版社，1998：279-285.