分子生物学技术

分子生物学技术（精选8篇）

分子生物学技术 篇1

关键词：分子 技术 原理 应用

摘要:本文主要是描述分子生物学技术的基本原理，通过其原理我们可以深刻的理解其功能

还有实际操作的过程。另外还列举了每项技术所给我们带来的好处及其现实的应用，通过实际的例子我们可以清楚的了解到其强大的功能和深远的影响以及将来的发展前景，充分体现出了科技给人类带来的创新及利益，可以说分子生物学技术将会改变人类未来的生活环境和生活条件，为人类的长期发展起到了不可替代的作用。下文将详细的介绍部分分子生物学的技术及其应用。

1.核酸分子杂交技术：具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下(适宜的温室度及离

子强度等)可按碱基互补原成双链。杂交的双方是待测核酸序列及探针，待测核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。核酸探针是指用放射性核素，生物素或其他活性物质标记的能与待定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。根据其来源和性质可分为CDNA探针，基因组探针，寡核苷酸探针，RNA探针等。

其应用：核酸分子杂交技术可以用来诊断弓形虫病分子。

2． 寡核苷酸微点隈杂交：是在特殊的固相支持物上原位合成寡核苷酸，使他共价结合与

持物表面，与平均长度为20-50nt的混合RNA或cDNA探针进行杂交，以提高杂交的特异性和灵敏度。应用共聚焦显微镜可检测跨越三个数量级的杂交信息。适用于低丰度mRNA的检测，以区分基因家族不同成员的差异表达特征，或鉴定同一转录在不同组织和细胞中的选择性剪接。但有工作量较大，成本较高，速度较慢的弱点。

其作用：激发细胞潜在的活性，寡核苷酸一方面能激发巨噬细胞的活性，巨噬细胞相

当于城市里的“大垃圾车”。专门处理衰老和死亡细胞。另一方面，寡核苷酸就像一把剪刀，定位寻找并及时剪断病毒基因链，快速吞噬病毒细胞，阻止病毒基因的转录和翻译，保护正常细胞不受侵害。

3.分子克隆技术： 在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体，可以得到插入DNA的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。将DNA片段(或基因)与载体DNA分子共价连接，然后引入寄主细胞，再筛选获得重组的克隆，按克隆的目的可分为DNA和cDNA克隆两类。其作用：克隆技术对保护物种特别是珍稀、濒危物种来讲是一个福音，具有很大的应用前景。从生物学的角度看，这也是克隆技术最有价值的地方之一，克隆技术被誉为“一座

挖掘不尽的金矿”，它在生产实践上具有重要的意义，潜在的经济价值十分巨大。首先，在动物杂种优势利用方面，较常规方法而言，哺乳动物克隆技术费时少、选育的种畜性

状稳定；其次，克隆技术在抢救濒危珍稀物种、保护生物多样性方面可发挥重要作用，即使在自然交配成功率很低的情况下，科研人员也可以从濒危珍稀动物个体身上选择适

当的体细胞进行无性繁殖，达到有效保护这些物种的目的。培育大量品种优良的家畜，如培养一些肉质好的牛、羊和猪等，也可以培养一些产奶量高，且富含人体所需营养元

素的奶牛。利用克隆等生物技术，改变农作物的基因型，产生大量抗病、抗虫、抗盐碱

等的新品种，在短时间内培育出大量农作物、从而大大提高农作物的产量。

4.核酸序列的测定：目前最常用的手工DNA序列测定技术，仍然是Sanger等(1977)提出的酶法，也称双脱氧末端终止法。这种方法生成相互独立的若干组带放射性标记的寡核

苷酸，每组核苷酸都有共同的起点，却随机终止于一种(或多种)特定的残基,形成一系列

以某一特定核苷酸为末端的长度，各不相同的寡核苷酸混合物，这些寡核苷酸的长度由

这个特定碱基，在待测DNA片段上的位置所决定。然后通过高分辨率的变性聚丙烯酰

胺凝胶电泳，经放射自显影后,从放射自显影胶片上，直接读出待测DNA上的核苷酸顺

序。

其作用：根据杂交膜的显色情况来判断：以阳性对照样显出的颜色为标准，样品的颜色

与阳性对照颜色相同或相近，则样品为病毒携带者；样品的颜色比阳性对照颜色深，则

样品为已发病或临死状态；样品不显出颜色，则样品为不带病毒（阴性）

5.PCR技术： 类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双

链或经PCR扩增

形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃

左右，引

物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为

反应原料，靶

序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保

留复制

链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链

又

可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基

因扩增放

大几百万倍。(Plateau)。到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。其作用：由于微生物的DNA具有高度特异性，它决定了各个物种的千差万别，利用一

特性，PCR技术对性病的病原体进行诊断，具有操作简便、报告结果迅速、敏感性和

特异性高等特点。但PCR技术检查也会出现假阳性结果，临床主要结合病史、症状、体征等综合分析判断，才不致贻误诊断。

6．电泳技术：电泳就是带电荷的样品在电场力的作用下，以不同的迁移行为而彼此得以分

离的方法。根据其载体介质的不同可以分为等电聚焦电泳、梯度电泳、纸上电泳、醋酸

纤维薄膜电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳等。

许多生物分子都带有电荷，其电荷的多少取决于分子结构机器所在介质的pH和组成。

由于混合物中各组分所带电荷性质、电荷数量以及相对分子质量的不同，在同一电场的作用下，各组分泳动的方向和速率也有差异。因此，在一定时间内各组分移动的距离也

不同，从而达到分离鉴定各组分的目的。

在电泳的过程种药品会受到电场力、分子筛作用、静电吸附作用、共价结合作用等等方

面的作用力。药品在这些作用力的综合作用下，泳动的速度产生差异，从而将不同的组

分分 离开来。

电泳的介质不同，则电泳的功能也不大相同，其所最适用的方向也是不一样的，最终检

测的指标也是不一样的。等电聚焦电泳常用于测定蛋白质的等电点，他最后测定的指标就是pH值。琼脂糖凝胶最常应用于核酸的检测之中，最后是以分子量的大小来衡量电

泳结果的。

其作用：

a)主要应用于分离各种有机物（氨基酸、多肽、蛋白质、酶、脂类、核苷、核苷酸、核酸等）。

b)可用于分析物质的纯度。

c)用于测定相对分子量。

d)与层析连用可用于蛋白质结构分析。

7.基因转染技术：将特定的遗传信息传递到真核细胞中，这种能力不但革新了生物学和医

学中许多基本问题的研究，也推动了诊断和治疗方面的分子技术发展，并使基因治疗成为可能。目前基因转移技术已广泛用于基因的结构和功能分析、基因表达与调控、基因

治疗与转基因动物等研究。本部分将介绍目前基因转移的主要方法；重点介绍基因转移的病毒方法的基因转染技术。

其作用：用于转染的质粒DNA必须无蛋白质，无RNA和其了化学物质的污染，OD26

0/280比值应在1.8以上。应用酚-氯仿抽提法制备的质粒DNA一般难以达到此标准，目前大多采用进口的术提取纯化试剂盒。

8.荧光原位杂交技术：应用核素标记核苷酸制备探针，通过放射自显影检测杂交信号。应

用核素标记的探针其敏感性可以检测到中期染色体上几百个碱基的单拷贝靶核苷酸序

列，敏感性虽高，但定位不够精确。FISH具有探针稳定、操作安全，可快速、多色显示

多个不同探针的杂交信号等优点。FISH的灵敏感与探针标记方法和检测仪器性能有关，探针标记时掺入的修饰核苷酸比例直接影响杂交信号强度。FISH探针一般采用随机引物

法或切口翻译法，如将PCR技术引入FISH探针标记，可使其灵敏度提高到0.25kb。

应用慢扫描CCD配合影像处理理软件，增强信噪比，有利于检测微弱信号，如应用TS

A系统能将杂交信号再放大1000倍，可用于单拷贝基因的定位。FISH分辨率大约为1-

3Mb,如果应用强变性剂处理染色体，让DNA分子从蛋白质中分离出来，使双DNA完全

伸展并粘附在玻片上，经引处理后，分辨率可达1-2kb。还可采用对分裂中期染色体进

行显微解剖法以提高分辨率。FISH的另一个特点是可以联合庆用地高辛、生物素等多种

标记系统，在一次杂交中可检测多种探针在染色体上的位置及探针间的相互关系，即多

色FISH或多靶FISH。

其作用：被广泛应用于肿瘤研究中的基因扩增、易位重排及缺失等的检测，在肿瘤

诊断和鉴别诊断、预后和治疗监控等方面都有重要意义。

分子生物学技术 篇2

1 分子生物学产生的历史回顾

21世纪是生命科学的世纪, 而生命科学的前沿又是分子生物学, 那么分子生物学是怎样一步步展现出其蓬勃发展的趋势的?让我们先看一看19世纪后半叶对生物遗传的认识。说到遗传, 不得不提到遗传学的奠基人奥地利遗传学家孟德尔, 它通过对果蝇的形貌和染色体各部分关系的研究, 发现杂交能改变遗传性状, 这一发现在遗传学上的意义在几十年后才被认识。到了1940年, 基因与酶、核酸与蛋白质的关系已开始受到重视, 但由于当时错误地认为DNA是四链环状结构, 没能认识基因的本质, 更无法指出染色体与DNA的关系。直到1944年Avery等在研究肺炎双球菌时, 发现它们的遗传特性可因加入DNA而发生特异改变, 从而阐明了DNA在遗传中的作用, 作为基因载体的染色体是DNA而不是蛋白质。但由于当时不了解DNA真正的分子结构, 所以无法认识到他对遗传学的真正意义。把这一工作向前推动一步的是马丁和辛格的纸上层析技术, 他使分离组成蛋白质的20种氨基酸和组成核酸的四种核苷酸成为可能。在此基础上, 查加夫运用这项新技术在研究构成核酸的四种单核苷酸的比例关系时, 发现胸腺嘧啶与腺嘌呤等分子数, 胞嘧啶与鸟嘌呤等分子数。此后Rosalind Franklin获得了DNA的高清晰度×线衍射照片, 显示出DNA分子呈螺旋状, 密度分析显示为双链。这两个发现后来成了沃森和克里克提出的DNA双螺旋结构理论的重要依据, 提出了DNA的双螺旋结构模型, 该模型建立标志着分子生物学的诞生。从上述历史回顾中, 我们不难看出在该学科的形成过程中, 围绕着遗传分子DNA结构和功能关系的探讨起了决定性的作用。

2 分子生物学技术在临床兽医学上的应用

2.1 核酸的分子杂交———基因探针技术

基因探针技术是临床应用最早的分子生物学技术, 至今仍长盛不衰。它不仅用于微生物等基因鉴定方面, 而且在印迹技术如方面以及新近成为热门的基因芯片技术方面都有广泛应用, 不少探针已商品化。

2.2 PCR技术

PCR技术是一种体外模仿体内DNA复制过程的技术。可以在短时间内大量复制出原来很少的DNA。其作为一种新的疾病检测手段, 具有灵敏、特异、简便、快速等优点, 可以从一根毛发、一滴血、一个细胞中扩增出足量的DNA供分析诊断PCR技术已逐渐应用于遗传性疾病、肿瘤及感染性疾病等的诊断。但该技术大多为定性分析, 结果重复性差、可靠性低。因而, 给临床诊断带来混乱。近年来常规PCR技术用于诊断、鉴定、科研、制备探针和进一步结合基因工程进行产品开发等, 是一项极其有效、非常实用的技术随着分子生物技术的发展已衍生出许多新方法新技术, 如定量PCR技术、荧光PCR技术、巢式PCR、不对等PCR等。

2.3 DNA (基因) 酶切图谱分析

DNA (基因) 酶切图谱分析即用特定的限制性酶消化DNA长链后, 可以得到核酸的片段。由于不同的DNA碱基序列不同, 用识别某一特定碱基序列的限制酶进行酶切时, 所得到的DNA链片段的长短也不一样。片段的长短可用凝胶电泳进行分离后, 与一系列已知分子量的标准参照物进行比较, 大体计算出各片段的分子量或碱基数。这一方法已广泛应用于临床基因诊断。例如, 当一个基因发生点突变后引起某一限制酶识别点改变, 就可以用本法检测出来。临床和科研中已沿用多年的DNA限制性片段长度多态性分析 (RFLP) , 就是本法具体应用的典型例子。在畜群中, 各个体基因的核苷酸序列会存在一定差异, 称为基因多态性。基因多态性位点普遍存在于动物的基因组中, 某一致病基因与特定的多态性片段紧密连锁, 就可以用这一多态性片段作为一种“遗传标记”来判断畜群或幼畜是否携带有致病基因。目前认为基因多态性是个体的“身份证”;有的虽然不表现疾病, 但也许会影响对药物的反应和用药效果, 因而有人提出将来会出现按个体基因型选择用药的种类和剂量的所谓“个体化”用药。

2.4 单链构象多态性 (SSCP) 分析

单链构象多态性是一种简单、有效、快捷、廉价的检测非常少量的基因组DNA或c DNA突变的技术。其原理及技术要点是:由于单一碱基的替代, 引起DNA链构象改变。后者可导致DNA在非变性凝胶电泳中出现迁移率的改变。因此, 首先用PCR技术扩增所检验的模板, 然后进行变性、电泳、显示。根据显示的条带与标准参照物对比, 即可判断所测DNA链是否有变异。

2.5 DNA序列测定

上述方法仅能大致了解某一核苷酸链片段是否存在变异, 并不能确定哪一位点核苷酸发生变异和何种核苷酸取代了何种核苷酸, 这就要求进行基因测序。关于DNA测序的方法, 因其十分复杂, 一般临床实验室无法进行。有必要时可委托有条件的公司或研究机构进行, 本文从略。由近几年世界范围进行的人类基因组计划 (其主要步骤是基因测序) 可知, 当今基因测序是一项大规模工程, 可以自动化进行。

2.6 DNA微阵列 (DNA microarray) 技术

DNA微阵列技术又称蛋白质微阵列技术、生物芯片技术, 其是当前分子生物学领域最热门的技术, 国内外在竞相开发, 微阵列技术的大致步骤是:在一小片固相基质上, 高密度地点上成千上万个DNA片段, 制成微阵列, 即DNA或生物芯片。检测时采用分子杂交手段, 将荧光标记的标本与微阵列进行杂交, 杂交完成并洗涤后, 用激光共聚焦显微扫描仪检测荧光信号, 通过微机处理分析, 即可获得检测结果。目前国内外已制出多种生物芯片商品, 其实际应用亦已逐步展开。据文献报道, 微阵列技术应用范围极广如致病微生物的检出、癌基因及抑癌基因、组织配型、基因表达的研究、基因功能分析、基因制图、基因突变和多态性的检测等, 是一项非常有发展前景, 适合临床检验应用的先进技术。

2.7 荧光原位杂交染色体分析 (FISH)

荧光原位杂交染色体分析是一种在染色体上进行基因定位的技术, 其基本原理和步骤是:在已知某靶基因核苷酸序列的前提下, 先合成与靶基因互补的经荧光标记的DNA探针, 与常规方法制备的中期染色体进行原位杂交。在荧光显微镜下可以观察到该靶基因所在的染色体 (臂、区、带、亚带) 。其是一项非常有用的技术, 它不仅可用于基因在染色体上定位的研究, 而且可直接用于实验室诊断。例如, 慢性髓系白血病患者的9号与2号染色体的长臂相互易位所形成的Ph染色体, 形成了一个融合基因—bcrabl, 这是该病发病的重要因素。早先用染色体分析鉴定这种染色体变异, 准确性差, 阳性率也不高。改用bcrab基因探针进行原位杂交很容易鉴定, 并且不一定需要分裂中期的染色体, 在核内处于间期的染色体也可检出。目前在各类白血病中, 已鉴定出好几种类似的融合基因。为此, 当前对白血病的实验室诊断, 已由过去的MIC改为MICM, 后一M即指分子生物学。FISH在基因定位研究和诊断中的应用还很多。

2.8 单抗阻断ELISA检测副鸡嗜血杆菌血清型特异性抗体

苗得园等在副鸡嗜血杆菌A, C型特异性单克隆抗体的基础上成功建立了能区分A, C血清型抗体的阻断ELISA诊断方法。并应用此法对9种常见病原体阳性血清及多份免疫鸡、人工感染鸡、临床可疑病鸡血清和阴性血清进行了检测, 结果证明, 本法具有较好的特异性和敏感性, 而且操作简便、快速, 是一种适用于鸡传染性鼻炎的诊断、流行病学调查、检疫和监测的良好方法。

3 小结

一般来说, 常规诊断技术具有应用简便、快速、易于掌握、费用低等优点, 是经历了漫长的历史发展过程得以巩固和完善的, 因此, 具有比较强的生命力。而生物高科技诊断技术却不具备这样的优势, 不论是单克隆抗体还是核酸探针PCR等, 其试剂的制备方法都比较复杂, 需要昂贵的仪器设备和诊断试剂, 对操作者的技术要求也较高, 甚至对检测结果的综合评价也不很容易掌握。但是, 现代生物技术作为一种高新技术, 有着常规诊断方法不能比拟的优越性, 分子生物学检测技术具有极高的敏感性与特异性, 能够区别细菌和病毒的疫苗株和野毒株, 甚至可区别病毒间单个核苷酸的差别, 可以监测病原体的变异和漂移, 预报疫病的大流行, 核酸探针和PCR技术还可检测出整合到宿主体内的病原体, 对于进行毒株鉴定、检测隐性感染和免疫损害性疾病都具有重要意义。因此, 虽然在短时间内这些诊断新技术难以真正达到推广应用, 但对于重大疫情的及时预报和准确定性都是不可或缺的。

参考文献

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[8]温进坤, 等.医学分子生物学理论与实验技术[M].北京:科学出版社, 1999:1.

分子生物学技术 篇3

【关键词】 分子生物学；相关检查技术；霍乱弧菌

霍乱是由霍乱弧菌感染引发的一种流行广泛的甲类传染病^[1]。霍乱弧菌是肠道传染病霍乱的病原体^[2]。人类是霍乱弧菌的唯一易感者^[3]。被感染者，往往表现为腹泻、剧烈呕吐、脱水、甚至死亡。从1817年至今，人类累计经历了7次大规模流行的霍乱。霍乱，它具有起病急骤、传播迅速、波及广泛、病死率高等特点，霍乱弧菌广泛的分布自然界中，可以通过污染水源及食物而引发疾病。对于霍乱的预防及治疗的关键在于，及时监测疫区外环境标本。对霍乱弧菌做出迅速、准确的检测是霍乱防治的重要方法。传统的分离培养方法费时费力，不能适应疾病的快速发展，将分子生物学的相关检测技术应用于对霍乱弧菌的检测，可精准、快速的进行检测，为疫情的处理，临床诊断提供了及时可靠的依据，同时也可有效追踪传染源，确定霍乱菌株类型，预测霍乱的流行趋势。本文将对几种用于霍乱弧菌分子生物学检测技术，作简单的介绍。

1 PCR

PCR技术主要包括：普通PCR、荧光PCR、套式PCR、多重PCR等。

1.1 普通PCR 普通PCR是通过检测出霍乱弧菌0139和01菌群的ctxA、ctxB基因，继而检测属于霍乱弧菌并检测出其毒力基因的常规方法。Shirai^[4]依据LT和CT的高度同源性，建立了基于ctx基因的特异的PCR检测方法，它检测细菌染色体的灵敏度很高，能检出仅含三个活菌的樣本。

1.2 荧光PCR 荧光定量PCR，它是通过荧光或者荧光燃料标记的特异探针，对PCR的产物进行跟踪标记。它具有无需电泳、快速定量、无交叉污染等诸多优点，被广泛的应用于临床。应用荧光PCR可快速有效的检测出霍乱弧菌0139群、01群、非0139群、非01群毒素的相关基因。

1.3 套式PCR 套式PCR，也可称为巢式PCR，即使用两对PRC引物来扩增完整的片段。套式PCR中，第一对引物扩增片段的方式与普通PCR极为相似，第二对引物也叫做巢式引物，他们往往结合在第一次PCR产物的内部，这就导致第二次PCR扩增的片段会短于第一次。巢式PCR，它具有非常高的特异性。Susanna等依据0139群O抗原合成相关基因片段建立的套式PCR可用于0139群霍乱弧菌的特异检测^[5]。

1.4 多重PCR 多重PCR，也可称为复合PCR或者多重引物PCR，它是在同一个PCR反应体系中加入两对及以上的引物，在同一时段，扩增出许多的核酸片段，它具有高效性、系统性、经济便捷性等诸多优点。

2 AFLP

AFLP（扩增片段长度多态性）是一项新型的分子标记技术，是由荷兰的Pieter Vos 等在1993年发展起来的一种多态性DNA检测新方法，它具分析需要DNA含量少，可重复性好，多态性强，分辨率高，无放射线损害，适用性广，稳定性好等诸多优点。AFLP技术的原理：对基因组酶切后的片段，进行选择性扩增，已获取的扩增片段经电泳检测，继而检测出获得的不同长度的扩增片段。Jiang^[6]采用AFLP技术分析不同环境，不同地点的临床分离的霍乱弧菌多态性，结果显示分离的临床0139菌株及01菌株在遗传学关系上要比环境中的0139菌株及01菌株更为紧密。AFLP分析与PFGE、RFLP、RAPD、Rep-PCR等适应范围相似，并兼备以上各种方法的优点，且分辨率极高，稳定性强，可为临床工作提供丰富信息。

3 PFGE

PFGE（脉冲场凝胶电泳）是一种常用的分离大分子核酸的方法。用脉冲场凝胶电泳对霍乱弧菌进行分型，其分辨力更高，可为霍乱弧菌分离株间进行同源性分析、遗传相关性分析、追踪传染源、预测疫情变化、防治措施的制定提供可靠依据。脉冲场凝胶电泳分辨力高，重复性好，即使在不同实验室，所得结果仍具可比性。

4 MLST和MLEE

MLEE（多位点酶电泳法），它以一个基因一种酶学说为依据，通过监测酶电荷及分子量的变化情况，来推算对应位点的多态性，然后进行综合分析，从而获悉细菌的具体分型及遗传学特点。但是，不同实验室间结果不可进行比较。

MLST（多位点序列分析），是一种新型的细菌分型技术，它由MLEE改良而来，它比PFGE的分辨力更高。

5 MLVA

MLVA（多位点可变数目串联重复序列），是在PCR基础上发展起来的新型技术，具有高度多态性的特点。对DNA的纯度要求不高，特异性高，重复性好，可得到数字化的结果，可进行实验室间比对，且可在短时间内大量的处理样品。

6 讨 论

PCR技术具有特异性强、灵敏度高、检测快速、成本低廉等诸多优点，但是，在菌株遗传关系分析及菌株分型方面不如其他的分子生物学检测手段，所以，PCR技术在临床主要被应用于早期对菌株的筛查。AFLP技术是以PCR技术为基础的新型技术，它继承了PCR的优势，但更加的可靠，与PCR相比，它可同时检测出大量不同的核酸片段，一次扩增就能分析比较几十个甚至百个基因位点，且不需制备探针，不需预知基因的序列特点。但，AFLP技术价格昂贵，对DNA纯度，内切酶质量有很高的要求，模板反应往往迟钝，还可能发生缺失或错配的现象。与AFLP技术相比PFGE是一种操作简便、稳定性好、分辨力高的方法。PFGE已经被公认为多种细菌基因分型的标准，是目前较为成熟的基因分型方法。但，PFGE技术也具有一定的局限性，如耗时久，未形成国际同一标准，不利于实验室间比较等。PFGE技术与MLST相比，MLST建立有大型的国际化数据库，可以进行实验室间的比对，也可作为国际流行病研究的依据。但MLST技术费用高，工作量大，技术要求极为严格，设备昂贵，所以并不适用于暴发流行的常规检测。MLVA是以PCR为基础的新型分型方法，它对DNA的纯度要求不高，特异性高，重复性好，可得到数字化的结果，可进行实验室间比对，且可在短时间内大量的处理样品。

综上所述，各种分子生物学检测手法各有千秋，可以互相取长补短，我们可以根据检测的目的以及实验室的现有设备选取合适的方法，用于临床诊断及研究。

参考文献

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分子生物学技术 篇4

一.选择题（在备选答案中选择一个最佳答案,每题2分,共20分）:

1.在核酸提取时,常需要使用氯化钠,醋酸钠等盐溶液,真正的目的是（）

A.中和核酸的负离子,使其易于沉淀B.调节PH值

C.保持核算的完整性D.提高核酸的浓度

E.无特定目的2.在一个DNA分子中,如G所占摩尔比为17.2%,则A所占摩尔比为（）

A.82.8%B.32.8%C.17.2%D.65.6%E.无法计算

3.下列那项不是扩增反应所必需的?（）

A.引物和模板B.dNTPC.Mg++D.DNaseE.缓冲液

4.下列那项是分子生物学技术形成的理论基础?（）

A.基因结构与功能的关系B.基因结构变异与疾病的关系

C.病原微生物的基因结构特征D.基因的表达.调控与疾病的关系E.以上皆是

5.分子生物学检验技术主要包括那些技术?（）

A.核酸分子杂交技术B.DNA测序技术

C.PCR技术D.DNA重组技术

E.以上全是

6.下列哪项检测需应用分子生物学检验技术?（）

A.肝功能检测B.乙肝两对半检测

C.乙肝病毒DNA(HBV-DNA)检测D.肿瘤细胞培养

E.病原微生物培养

7.在核酸的分离纯化过程中,为保证其一级结构的完整性,应采取（）

A.尽量简化分离步骤,缩短提取时间B.适当延长提取时间

C.在37摄氏度条件下进行D.加入Mg++,Ca++等二价金属离子E.以上全是

8.有一核酸样品,测得A260/A280=2.0,请问该样品属于哪类核酸样品?（A.DNAB.RNA）

C.是DNA,但有蛋白质污染D.是RNA,但有蛋白质污染

E.DNA和RNA

9.在RNA提取和纯化过程中,为避免Rnase污染而导致RNA的降解,应采取（）

A.在洁净的实验室里操作B.带手套和口罩

C.所用器材高压消毒或DEPC处理D.冰浴下操作

E.以上皆是

10.随机引物标记法全程标记DNA时,需选用下列哪种酶?（）

A.DNA多聚酶I的Kelnow片段B.TaqDNA聚合酶

C.限制性内切酶D.DNA连接酶

E.末端转移酶

二.判断题：(你认为下列叙述正确的请在题后括号内打√,错误的打×，每题2分,共6分)

1.双脱氧核酸链终止法是最常用的DNA测序技术（）

2.TapDNA聚合酶的作用是催化DNA合成，但由于缺乏3’→5’外切酶活性，无校正功能，所以在复制合成新链过程中可能会发生碱基错配，导致PCR产物的错误（）

3.采用加热煮沸法可使RNase完全失活（）

三：填空题(每空格2分,共24分):

1.在选择核酸的分离纯化方法，应遵循的总原则是：一是保证核酸（一级结构的完整性）；二是尽可能（排除其他分子的污染，保证核酸样品的纯度）。

2.在PCR反应中，Mg++是个至关重要的因素，浓度（过低）会降低酶的活性，浓度（过高）又会导致非特异性扩增。

3.用于核酸杂交的普通硝酸纤维素膜最大的优点是（本底低），因而最容易检测杂交信号，缺点是（脆性大）易破裂，且队＜５００bp的核酸结合力低。

4． 整个核酸杂交反应主要由（预杂交）、（杂交）和（洗脱）三个步骤组成。

5.转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上的核酸，其与滤膜的结合是松散的，需做进一步的固定，常用的固定方法是（烘烤）、（紫外线固定）和（碱固定）。

三.名词解释：(每题4分,共20分):

1.融点曲线分析技术：是根据野生型序列和突变序列因不同Tm而产生不同的融点曲线而设计的。

2.探针:指所有能与特定的靶分子发生特异性的相互作用，并可以被检测的分子。

3.Tm值： DNA熔解温度，指把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度。

4.转染:将外源DNA直接导入真核生物细胞的过程称为转染。

5.转化:将重组的DNA分子导入细菌，使其在细菌体内扩增及表达的过程称为转化。

四.问答题:（每题10分，共30分）

1.简述限制性内切酶的定义、命名原则和分类。

答：定义：限制性内切酶是能识别和水解双链DNA分子内特异序列的核酸水解酶类。

命名：通常由3个斜体字母表示，第1个大写字母为来源微生物的属名第1个字母，第2、第3个小写子母取微生物种名的头两个字母。

分类：根据酶分子组成及裂解方式的不同，将限制性内切酶分3类，Ⅰ类和Ⅲ类限制性内切酶在同一酶分子中兼有修饰（甲基化）作用和依赖于ATP的限制水解活性，Ⅱ类限制性内切酶能识别并水解特异性的核苷酸序列是DNA重组技术中最重要的工具。

2.PCR引物的设计应遵循哪些原则。

答：1.用于PCR反应的引物需要两条，分别设在被扩增目的的片段的两端，并分别与模版正负链序列互补。

2.引物的长度一般以18-25个核苷酸为宜，引物过长容易产生寡核苷酸的链内互补，形成发夹状结构，影响引物和模板之间的互补。

3.两条引物之间尤其在3’端的序列不能有互补，以免形成引物二聚体。

4.引物的碱基组成应平衡，避免出现嘌呤、嘧啶碱基堆积。

5.PCR扩增中的退火温度是根据引物的Tm值而决定的，两条引物的Tm值不能差太大。

6.根据需要，可在合成引物时于其5’端加修饰成分。

3.试述实时荧光PCR水解探针法的实验原理？

分子生物学技术 篇5

分子生物传感器可以广泛地应用于对体液中的微量蛋白、小分子有机物、核酸等多种物质的检测。

在现代医学检验中，这些项目是临床诊断和病情分析的重要依据。

能够在体内实时监控的生物传感器对于手术中和重症监护的病人很有帮助。

Skladal等用经过寡核苷酸探针修饰的压电传感器检测血清中的丙型肝炎病毒(HCV)并实时监测其DNA的结构转录和聚合酶链式反应(PCR)扩增过程，完成整个监测过程仅需10 min且装置可重复使用。

Petricoin等用压电传感器研究了破骨细胞生成抑制因子(OPG)和几种相应抗体的相互作用，研发出可快速检验血清中OPG的压电免疫传感器。

分子美食 烹饪技术 篇6

用五彩水果装饰，精致惹人爱的鱼籽配上口味绝伦的雪蛤，视觉和味觉的完美享受；化掉酒糟香浸法式肥鹅肝，绝味鹅肝触动舌尖，让您体验“爵位”口感„„2月20日，笔者在东方御花园酒店会所发现了一种叫分子美食的烹饪技术，与分子美食来了一次零距离接触。

看外观：视觉冲击出人意料

“保持食材原汁原味，看着是一种东西，吃着是另外一种东西，这是分子美食的奇妙之处。”东方御花园酒店会所相关负责人介绍。在现场，一道名为“堂煎牛排配养身南瓜胶囊”的菜，形似胶囊的菜品，牛排配南瓜，重养生抢口味，轻轻一咬，香味扑鼻，色香味俱全，十全十美。顾客赞不绝口：“看着就很有食欲，带来了视觉惊喜。”

品内涵：尊重食材原始成分

分子美食在顾客眼中是视觉惊喜，在行家看来，更多的是内在营养保持。

“分子美食烹饪技术，改变了传统火工、刀工和铁工齐上的烹饪方式，对食物原料特性持最大尊重态度。”东方御花园酒店会所分子美食厨师XXX认为，传统制作较多采用高温，食材内部的营养成分易遭破坏。“分子美食烹调技艺不用火，较少使用调料，尽量保持原态。天然食物，吃得放心。”

论发展：创新融合之路迢迢

分子美食是对传统烹饪技术的冲击，同时也在入乡随俗。“分子美食技艺可与任何中国菜系结合，做出令消费者欣喜的口味，做到中国千年传统饮食文化和全新烹饪技术的完美融合。”东方御花园酒店会所相关负责人如是说。

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分子生物学技术 篇7

聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction, PCR) 自1985年建立发展至今, 已成为现代分子生物学的核心技术, 在科学研究和临床诊断中都发挥了巨大的作用。这项技术经过不断开发和改进, 已经应用到动物检疫领域的各环节, 给检疫工作带来了极大便利。此外, 在PCR技术基础上衍生出了许多新技术, 而在动物检疫中逐渐被采用的PCR技术主要有常规PCR和实时荧光PCR技术。

1 常规RCR技术

常规PCR技术指在DNA聚合酶催化下, 以母链DNA为模板, 以特定引物为延伸起点, 通过变性、退火、延伸等步骤, 体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程, 是一项DNA体外合成放大技术, 能快速、特异地在体外扩增任何目的DNA。

多重PCR技术是在常规PCR基础上发展而来的。不同于常规PCR技术的是, 多重PCR技术是在同一个体系中加入多对引物, 同时检测多个目标序列的存在。在把单重PCR合并成多重PCR之前要进行不同扩增子之间引物的分析, 条件进一步优化。实际工作中通常使用引物不超过5对。岳丰雄等[1]根据猪圆环病毒2型 (PCV2) 、猪细小病毒 (PPV) 、猪伪狂犬病病毒 (PRV) 、猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV) 基因序列设计了4对引物, 分别用于扩增PCV2 ORF2、PPV NS1、PRV g B、PRRSV N基因的目的片段, 建立了检测PCV2、PPV、PRV、PRRSV的多重PCR诊断方法。

2 实时荧光定量PCR技术

2.1 用于出入境动物及产品的细菌学检测

罗宝正等[2]根据猪链球菌Ⅱ型的cps2Ⅰ基因序列设计引物和Taq Man荧光探针, 建立了可以快速、定量检测猪链球菌2型的检测方法, 整个反应可在0.5 h内完成。从收到样品到实时荧光PCR检测结果的完成也只需要2 h左右, 大大缩短了检验过程, 这是包括细菌分离在内的其他方法所无法比拟的。该方法还有特异性强、灵敏度高、重复性好的优点, 可以在出入境检疫和兽医监督部门用于Ⅱ型猪链球菌的检测。其中珠海检验检疫局建立的多重荧光PCR检测技术同时检测2型猪链球菌的荚膜多糖基因cps2I和溶菌素释放蛋白基因MRP, 对于控制疫情、减少扩散起到积极作用。

2.2 用于出入境动物及产品的病毒学检测

2.2.1 禽流感病毒的检测

禽流感是严重危害养禽业的重大传染病之一, 世界动物卫生组织 (OIE) 将其列为A类传染病, 我国也将其列为进境动物检疫一类检疫性传染病。禽流感病毒以H5、H7、H9亚型的危害最大, 现有的荧光PCR检测方法每次只能检测禽流感病毒单个亚型, 费时费力。安泓霏等[3]采用多重实时荧光RT-PCR技术, 同时检测禽流感H5、H7、H9亚型, 并研制相应的快速检测试剂盒。该方法敏感性高、特异性强, 与传统的鸡胚病毒分离法相比敏感性高, 可直接用来检测咽喉、泄殖腔拭子和禽肉中的禽流感病毒, 检测时间明显缩短, 从收样到出结果只需要4 h。

2.2.2 新城疫病毒的检测

新城疫是严重危害养禽业的传染病, OIE将其列为A类传染病, 我国也将其列为进境动物检疫一类检疫性传染病。OIE推荐检测新城疫病毒的方法是鸡胚病毒分离法, 需要21 d, 检测周期较长。张鹤晓等[4]根据新城疫病毒M、N和F基因序列设计多条引物和探针, 建立了新城疫病毒通用实时荧光RT-PCR检测方法, 不仅可以检出中强新城疫毒株, 也可检出缓发型毒株和疫苗毒株, 敏感性远远高于血凝试验, 可以实现进出口禽肉的快速检测。

2.2.3 口蹄疫病毒的检测

口蹄疫是一种引起偶蹄类动物高度传染的病毒性疾病, 已给世界畜牧业造成了严重危害, 被OIE定为A类传染病。目前对该病的诊断方法主要有中和试验、补体结合试验和ELISA等。而这些方法存在敏感性、客观性差等缺点, 不能满足现代进出口贸易对检测的要求。T.B.Rasmussen等[5]根据口蹄疫病毒3D基因序列设计引物建立了快速检测口蹄疫病毒的FQ-PCR (荧光定量PCR) 方法, 该方法对样品中口蹄疫病毒基因组RNA的检测灵敏度可达10个基因拷贝, 可用于口蹄疫病毒各血清型的检测, 大大提高了检测效率。

2.2.4 猪瘟病毒的检测

猪瘟被OIE列为A类疾病, 要求会员有义务报告疫情[6]。我国将其列为一类动物疫病[7]。姚俊[8]以猪瘟病毒属成员高度保守的5'端非编码区作为扩增靶区, 设计并合成了1对Taq Man RT-RCR引物、1条Taq Man探针和3条RNA标准品制备引物, 建立了既能检测野毒, 又能检测疫苗毒的实时荧光定量PCR检测方法。结果表明, 所建立的方法具有特异、快速、灵敏、可重复性和线性关系好的特点, 不仅适合于猪瘟临床样品的早期检测, 也适用于疫苗生产过程中的质控及疫苗制品的效价评估。

2.2.5 猪水泡病病毒的检测

猪水泡病被OIE列为A类传染病, 临床症状与猪口蹄疫极为相似, 已引起严重的公共卫生问题, 因而快速和可靠的诊断对于猪水泡病的控制和消灭至关重要。钟金栋等[9]按照猪水泡病病毒VP1基因序列, 设计合成引物和探针, 建立了实时荧光定量RT-PCR技术, 对猪水泡病病毒进行了特异性、敏感性和重复性试验。结果表明, 实时荧光定量RT-PCR可检测到每个反应相当于100拷贝病毒RNA;与口蹄疫病毒等其他水泡性病毒不发生交叉反应, 可在收到样品后4 h之内作出定性、定量检测结果。

2.2.6 猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV) 的检测

猪繁殖与呼吸综合征被OIE列为B类传染病, 我国也将其列为二类传染病。本病于1987年首次在美国被发现, 现已迅速传播至全世界各养猪发达的国家和地区, 给世界养猪业造成巨大的经济损失, 现已成为规模化猪场繁殖障碍和呼吸道疾病的主要疫病之一。范忠军等[10]根据M基因设计的引物和探针建立的荧光RT-PCR技术具有灵敏、特异和快速等优点, 只需3 h即可完成整个试验过程, 可用于PRRSV的早期检测、预防控制、进出口检疫及基础研究等。

2.2.7马病毒性动脉炎病毒的检测

马病毒性动脉炎是马属动物之间通过呼吸道或生殖道传染的病毒性传染病, 被OIE定为M类传染病, 是各国马匹进出口检疫中必检的二类传染病。目前对该病的诊断方法主要有中和试验、补体结合试验、免疫沉淀反应、荧光抗体测定和ELISA等, 但对于进出境快速、准确的检出要求相差甚远。杨松等[11]选取马病毒性动脉炎病毒高度保守的ORF7基因序列设计引物和探针, 建立了一步法实时荧光定量RT-PCR来检测马病毒性动脉炎病毒。该方法省时, 操作简单, 定量准确, 特异性强, 无交叉污染, 具有很大实用价值。

2.2.8 牛传染性鼻气管炎病毒的检测

牛传染性鼻气管炎被OIE列为B类传染病, 我国将其列为进境动物检疫二类传染病, 在我国与澳大利亚、新西兰和美国等签署的进口牛双边协议中均明确规定对IBR进行严格检疫[12]。当前对进出口牛的检疫主要是血清中和试验、ELISA和病毒分离鉴定, 检测周期长, 效率低。蒋珊珊等[13]根据牛传染性鼻气管炎病毒保守基因g B和g E分别设计2对引物及相应的Taqman探针, 建立了一种快速检测牛传染性鼻气管炎病毒的方法。该方法从核酸提取至检测完成, 仅需3 h左右, 且实行完全闭管式操作, 杜绝了扩增产物污染而引起的假阳性, 在牛传染性鼻气管炎的诊断、监测等方面应用前景广阔。

2.2.9 牛病毒性腹泻病毒的检测

牛病毒性腹泻被OIE列为B类传染病, 我国将其列为进境动物检疫二类传染病, 该病毒呈世界性分布, 广泛分布于美国、澳大利亚、新西兰、匈牙利、加拿大、阿根廷、日本、印度以及非洲和欧洲许多养牛发达国家和地区, 是危害养牛业的重要病原之一。郭锐等[14]以牛病毒性腹泻病毒 (BVDV) 的保守基因序列为参考, 设计、优化出1对特异的PCR引物和一条Taq Man荧光探针, 建立了快速定量检测牛病毒性腹泻病毒的实时荧光定量PCR技术。该方法检测灵敏度比RT-PCR高100倍, 并且避免了常规PCR电泳检测所带来的高污染率, 特异性强, 重复性好, 操作简单、快速, 整个过程可在4 h内完成。适用于牛场BVDV感染的快速定量检测和肉类食品进出口检疫。

2.2.1 0 牛羊赤羽病病毒的检测

赤羽病被OIE列为B类传染病, 该病是目前对我国养牛业和养羊业危害较为严重的疫病, 也是我国从国外进口牛、羊必须检测的7种疫病之一。赤羽病的实验室诊断包括病毒分离、蛋白检测和核酸检测。其中核酸检测以其快速、特异等特点而成为病毒检测的一个重要发展方向。张吉红等[15]根据病毒保守片段S基因设计检测引物和探针建立了一套赤羽病病毒的实时荧光RT-PCR诊断方法。该方法不仅能够准确地检测牛羊赤羽病病毒, 而且检测出牛羊赤羽病病毒的最高稀释度可达1×10-5 (核酸含量约为1.18 ng/μL) , 比普通的RT-PCR灵敏度高1 000倍。在检出时间上比普通RT-PCR提前2~3 h得出结果, 可以为牛羊赤羽病病毒的流行病学调查和诊断提供有力的技术支持。

2.2.1 1 蓝舌病病毒的检测

蓝舌病是一种侵害反刍动物的虫媒传染病, 被OIE列为上报疾病, 我国将其列为一类动物疫病。对牛、绵羊和山羊等反刍动物实施蓝舌病病毒感染监测和控制是牲畜进出口国家防止引进和输出蓝舌病病毒新血清型的重要举措。尹惠琼等[16]通过对蓝舌病病毒不同血清型N S1基因序列比对, 以5'端基因为最保守的靶基因片段, 建立了基于Taq Man荧光探针技术的蓝舌病病毒实时荧光RT-PCR检测方法。该方法可对不同血清型BTV进行通用型检测, 并具有良好的特异性、敏感性和重复性, 检测时间短, 从RNA制备到检测结束可在3 h内完成。该方法可作为蓝舌病监测的技术储备, 为蓝舌病的有效防控提供可靠的技术支撑。

2.2.1 2 小反刍兽疫病毒的检测

小反刍兽疫 (PPR) 是由副黏病毒科麻疹病毒属的小反刍兽疫病毒引起的急性、烈性传染病。小反刍兽疫是OIE法定的A类传染病, 我国将其定为一类动物疫病。吴绍强等[17]根据Gen Bank上收录的小反刍兽疫病毒基因组全序列及N蛋白基因的序列, 在序列比较的基础上, 选择N基因的保守部位作为靶基因建立了小反刍兽疫Taq Man荧光PCR检测方法, 敏感性是常规PCR方法的100倍, 特异性强, 弥补了传统的血清学方法不能区分小反刍兽疫病毒和牛瘟病毒感染的缺点。该方法易于对患病动物及其产品进行早发现、早确诊, 可以满足口岸检疫的快检快放的要求, 对防止小反刍兽疫跨境传播、保障国内畜牧业的健康发展、维护国家声誉具有重要的意义。

2.2.1 3 羊痘病毒的检测

羊痘被OIE列为A类传染病, 是所有动物痘病中最为严重的一种, 我国将其列为一类动物疾病。常规诊断羊痘感染的方法有中和试验、荧光抗体试验、琼脂凝胶免疫扩散试验等, 这些方法费时, 费力, 特异性和敏感性不高, 不能满足快速、准确诊断的要求。康文玉等[18]参照羊痘病毒P32基因序列, 设计合成2套引物和1条探针, 建立了实时荧光PCR技术。该法检测快速、特异、敏感、可定量、同时检测大量样品, 可满足当前羊痘的诊断和进出口检疫的需要。

2.3 其他

除以上病原微生物的检测外, 实时荧光技术还用于其他多种细菌、病毒、寄生虫等的检测, 如结核、布氏杆菌、空肠弯曲杆菌、沙门杆菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、大肠杆菌、阪崎肠杆菌、志贺菌、诺沃克病毒、甲肝病毒、华支睾吸虫、旋毛虫等。实时荧光PCR技术还应用于动植物产品的转基因产品、动物源性饲料、食品或化妆品中牛羊源性成分的定性和定量检测。

3 展望

分子生物学技术 篇8

【摘要】随着分子生物学、基因组学和生物信息学的发展，微生物的分子水平上的研究也取得了快速发展，与其他方法相比，其灵敏度高、可重复好和可靠性好，是目前应用最广泛的方法之一。

【关键词】分子生物学；技术；肠道微生物

【中图分类号】R446.5【文献标识码】A【文章编号】1005-1074(2009)04-0032-01

人体肠道中寄生着种类繁多和数量巨大的微生物，构成了肠道微生态体系。这正常情况下，这些微生物对机体无害，或有利于机体的健康，为正常菌群。正常菌群参与宿主对营养素的消化、吸收与合成；刺激其免疫机制。这种与宿主的肠道相互依存又相互影响的关系形成了动态的微生物平衡[1]。微生物学研究表明，环境条件的轻微变化，均可导致机体微生态系统的变化，造成菌群的失调，对宿主的肠道功能产生不良影响[2]。肠道微生态的破坏，还可引起内外源性感染，干扰机体营养代谢和免疫功能，甚至严重影响机体健康，导致一系列疾病的发生。随着分子生物学、基因组学和生物信息学的发展，微生物的分子水平上的研究也取得了快速发展，与其他方法相比，其灵敏度高、可重复好和可靠性好，是目前应用最广泛的方法之一。

1肠道微生物总DNA的提取

肠道微生物总DNA的提取是研究胃肠道微生态系统的基础，只有获得尽可能完整的DNA模板才能为后续分析提供可信性。目前获得肠道菌群总DNA的方法主要有酚/氯仿抽提法、Chelex-100煮沸法、GuSCN/silica法，以及近年来一些大型公司推出的商业试剂盒。酚/氯仿抽提法间接从样品中获取基因组DNA是实验室常用提取细菌DNA的方法，金晶等[3]通过对酚/氯仿法提取肠道微生物总DNA进行优化，得到了基本完整的基因组DNA.这一经典的技术由于其操作过程不需要特殊的仪器设备，得到的DNA纯度相对较高，被广泛的应用。

2肠道微生物基因片段获取

Sharles等于1990年在E.Coli基因组中发现的一种基因间重复保守序列，大小约为126bp。1991年，Hulton等在Salmonella typhimurium，Yersinia pseudo- tuberculosis，Klebsiella pneumoniae和Vibrio cholerae中也发现这种高度保守的重复序列，由于该序列主要存在与肠杆菌科，故称之为肠杆菌基因间的重复共有序列（Enterobacterial repetitive intergenic，ERIC）。Versalovic等认为ERIC-PCR扩增的是两个相邻的ERIC保守序列之间的区域，由于不同的细菌基因组上的ERIC重复序列的数目和分布不同，从而得到由一系列大小不同片段组成的DNA指纹图谱不同地域和不同年代的同一株菌其指纹图谱一样，不同的方法提取基因组DNA，图谱具有良好的可重复性。潘莉等[4]为了了解以粪检有无白细胞区分的两类腹泻儿童肠道菌群结构的特征及其与健康儿童的差别，应用ERIC-PCR对其肠道微生物总DNA进行扩增，结果分析发现了一段与腹泻相关的未知基因序列。在检测运动员不同训练强度下肠道菌群结果变化ERIC-PCR也能取得很好的结果[5]。

3DNA遗传指纹图谱技术分析

3.1变性梯度凝胶电泳和温度梯度凝胶电泳变性梯度凝胶电泳(Denaturing GradientGel Electrophoresis，DGGE)是由Fisher和Lerman发明用于检测DNA突变的技术，其原理是利用长度相同的双链DNA片段解链温度的不同，通过梯度变性胶将DNA片段分离开来。DGGE可以用来检测除最高温度解链区域以外的所有发生单个碱基变化的DNA片段。另一个基于相似原理的技术，称为温度梯度凝胶电泳(Temperature Gradient Gel Electrophoresis，TGGE)，与DGGE的不同之处在于不是变性剂呈现线性梯度，而是温度呈现线性梯度，使得不同的核酸序列停留在凝胶的不同位置从而得以分离。该技术很突出的优点：可以分离具有细微差异的基因组片段；从凝胶中切下谱带，然后测序分析来揭示群落成员系统发育的从属关系，检测出特异细菌种群的存在；具有同时检测多个样品，可以对不同样品进行比较。

3.2限制性片段长度多态性限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）技术于1980年由人类遗传学家Bostein提出。该技术是利用限制性内切酶能识别DNA 分子的特异序列，并在特定序列处切开DNA分子，即产生不同长度大小、不同数量的限制性酶切片段，于是电泳图谱呈现多态性。末端限制性片段长度多态性分析(Terminal Restriction Fragment Length Polymorphisn，T-RFLP)与RFLP相似，只是在 PCR 引物末端标记荧光，扩增的基因片段被限制性内切酶消化后，那些带有荧光标记的末端限制性片段就可在DNA测序仪上检测出来。Cecilia等[6]利用T-RFLP技术分析抗生素治疗和服用益生菌产品对人类肠道微生物区系的影响，结果表明T-RFLP技术易于监控部分优势菌群，但是利用培养技术却很实现对它们的监控。

3.3分子杂交技术-荧光原位杂交荧光原位杂交(Fluorescence In Situ Hybridization, FISH)是在 20 世纪80 年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术，以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法。基本原理是：如果被检测的细菌基因组DNA纤维切片上的靶 DNA与所用的核酸探针是同源互补的，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。该法具有安全、快速、灵敏度高、探针能长期保存、能同时显示多种颜色等优点。人体肠道微生态系统的动态平衡对生理、健康有着重要作用，分子生物学技术的快速发展使研究人体肠道微生物各种群的数量、结构及动态变化更为直接和精确。当然，分子生物学技术人目前尚有一些缺陷，在与传统的培养鉴定方法方法结合使用，将能够在人体胃肠道复杂的微生物生态研究中发挥重要的作用。

参考文献

[1]杨汝德,李武明，许燕滨．动物和人类的肠道菌群的形成及意义[J]．微生物学杂志，1998，18（1）：52-55．

[2]顾国胜，任建安，黎介寿．结肠粘膜表面保护系统与肠道菌群[J]．中国使用外科杂志，2003,23（2）:118-120．

[3]金晶，彭颖，李晓波．快速提取肠道微生物基因组DNA的方法[J]．现代生物医学进展，2007，7（1）：100-103．

[4]潘莉，杜惠敏，黄海冬,等．腹泻儿童肠道菌群结构特征的ERIC-PCR指纹图分析[J]．中国微生态学杂志，2003，15（13）：141-143．

[5]乔德才，陈敬，魏桂芳，等．用DNA指纹图谱技术分析运动负荷对运动员肠道菌群区系结构的影响[J]．体育科学，2004，24（1）：73-75．

[6]Cecilia Jernberg, Asa Sullivan,et al. Monitoring of antibiotic-induced alterations in the human intestinal microflara and detection of probiotic strains by use of terminal restriction fragment length polymorphism[J].Appl Environ Microbiol,2005,71(1):501-506.