RNA干扰技术的合成技术和转运系统研究进展

RNA干扰技术的合成技术和转运系统研究进展（共3篇）

RNA干扰技术的合成技术和转运系统研究进展 篇1

RNA干扰技术的合成技术和转运系统研究进展

RNA干扰(RNAi)技术是近年发展起来的一项利用小片段双链RNA(dsRNA)导致特定基因表达沉默的新技术,其中约21～23 bp的小干扰RNA(siRNA)是RNAi的重要效应分子.RNA干扰技术的应用关键在于siRNA的`合理设计和有效转运系统.现主要综述siRNA的合成技术和各种转运系统,并比较各种方法的特点.

作 者：胡颖 叶枫 谢幸 作者单位：浙江大学医学院附属妇产科医院,杭州,310006刊 名：国际检验医学杂志 ISTIC英文刊名：INTERNATIONAL JOURNAL OF LABORATORY MEDICINE年，卷(期)：28(10)分类号：Q522.2关键词：siRNA 载体系统

RNA干扰技术的合成技术和转运系统研究进展 篇2

1 siRNA/shRNA介导的转录后基因沉默

转录后抑制 (post transcriptional gene silencing, PTGS) 是指内源基因在“异常RNA”的诱导下发生基因沉默的调控过程。被抑制的基因能够正常转录, 但转录后的m RNA产物会被迅速降解而失去正常功能。所以属于转录后基因沉默[2]。这些“异常RNA”介导RNAi的基本模式如图1所示。

首先, ds RNA与Dicer酶在胞浆中结合并被后者切割成21~23nt大小的dsRNA, 被称作siRNA。SiRNA的5’端是磷酸化的, 3’端突出2nt。

其次, siRNA与核酸酶等结合形成RNA介导的沉默复合物 (RNA-induced gene silencing, RISC) 。一般认为si RNA和具有核酸内切酶活性的Argonaute蛋白是RISC的必要组成部分[3]。最新研究又发现两个新的RISC组分:VIG (vasa intronic gene) 蛋白和d FXR (Fragile X related) 蛋白。RISC中的解旋酶在ATP作用下解旋si RNA。正义链被释放, 只含反义链的RISC被激活。活化的RISC通过碱基互补配对原则与同源的m RNA结合。随后蛋白的结构域发挥核酸内切酶的功能降解m RNA, 从而使目的基因沉默。

注:Dicer酶属于RNaseⅢ家族的一个亚型。它含有1个PAZ结构域, 2个ds RNA结合序列, 1个RNA酶Ⅲ结构域, 1个解旋酶结构域。Dicer的PAZ结构域与ds RNA末端结合, 2个RNA酶Ⅲ结构域以反向平行的排列方式形成假二聚体, 构成活化中心, 分别水解ds RNA的两条单链。注:RISC必要组成部分是si RNA和具有核酸内切酶活性的Argonaute蛋白。Argonaute蛋白包含2个结构域:PIWI和PAZ。PAZ结构域位于Argonaute蛋白的N端, PIWI结构域位于C端。Argonaute蛋白家族包括许多成员, 在人类细胞中, 有4个成员:Ago1~4, 可以和siR-NA或micro RNA结合, 但仅有Ago2介导靶m RNA的降解。

2 siRNA/shRNA介导的转录水平基因沉默

该机制通过siRNA与互补的DNA直接发生作用, 激发同源DNA甲基化的加强, 使目的基因转录受限, 表达关闭, 进而基因沉默。这一现象最初是在植物中观察到的, 与启动子区内CpG岛同源的siRNA能诱导RNA引导的DNA及组蛋白H3赖氨酸9甲基化, 使靶基因转录受抑[4]。2004年Kawasaki H[5]在MCF27细胞和哺乳动物正常上皮细胞中用si RNA干扰E2cadherin启动子CpG岛, 诱导出转甲基酶依赖的DNA和组蛋白H3赖氨酸9的甲基化, 同时抑制了E2cadherin基因表达, 并证实这种基因沉默发生在转录水平。此结果显示在哺乳动物中siRNA诱导启动子内甲基化是一个普遍现象, siRNA导致的转录沉默高度保守, 为特异性抑制哺乳动物基因功能提供了新手段。

3 microRNA介导的翻译水平基因沉默

MicroRNA是一种单链RNA结构, 长约19~21nt, 存在于基因组DNA的非编码区。现有研究证据表明miRNAs的原始转录产物是长约60nt的发夹状转录前体RNA (primi RNA) , 它含有一段特殊的茎环样结构, 可与靶mRNA通过尚不明确的碱基配对方式互补结合, 抑制m RNA的翻译, 在基因调控方面起到重要作用。MiRNA介导翻译水平抑制的机制:Drosha (RNaseⅢ家族的一个亚型) 能识别primi RNA中的茎环样结构并与之结合, 随之将茎环样结构的RNA片断切割释放[6]形成microRNA前体 (pre-microRNA) 。Pre-microRNA从细胞核内释放到胞浆, 被Dicer的PAZ结构域识别并结合, 加工成类似siRNA的microRNA。

成熟的microRNA由于其茎环样结构的一侧有一段特殊序列, 不能与靶mRNA完全互补, 因而不能降解靶mRNA, 但microRNA能与蛋白等结合形成RISC, 结合在靶mRNA的3’端非翻译区上, 阻断m RNA的翻译, 进而导致相应基因的沉默[7]。

4 非特异效应

许多研究表明, 当向哺乳动物转染大于30nt的长双链RNA时, dsRNA将激活双链RNA依赖的蛋白激酶 (dsRNA dependent protein kinase, PKR) 途径[8], 使EIF-2α因子磷酸化, 进而非特异性地抑制翻译, 使细胞内发生全面的细胞沉默。

5 RNAi机制目前存在的问题

近几年RNAi机制的研究取得了较大进展, 但对其认识仅仅是刚刚开始, 还有许多问题需要研究:

(1) 研究表明, Dicer的功能是将dsRNA加工成siRNA, 因此如果从体外直接导入siRNA则不需要Dicer。但人们却发现, 去除Dicer会明显降低RNA干扰的效率, 由此推测Dicer参与效应阶段。针对这一推测, 一些学者进行了研究[9], 提出Dicer在RISC装配中起作用, 例如在果蝇体内, Dicer-2、R2D2与siRNA结合形成复合物, R2D2可能“感知”siRNA 5’端的热力学稳定性, 决定哪条链进入RISC装配过程。具体过程尚不清楚, 可能是由其它未知的辅助蛋白参与的多步骤过程。Winston WM等[10]研究发现线虫sid-1突变体不产生系统性沉默现象, 由此推测RNAi信号的细胞间运动可能依赖跨膜蛋白;进一步研究发现果蝇和人体中未出现这种现象, 所以推测机体可能通过一种精密的调控系统决定是否产生系统性沉默现象, 其具体机理还需要努力研究。

(2) si RNA介导的转录水平的基因沉默与DNA的甲基化相关, 但如何使其甲基化仍不清楚, 是否有其它染色质修饰参与尚不清楚。Filipowicz等[11]在最新的研究提出:microRNA/RISC复合物阻断帽子结构依赖的翻译起始阶段, 可能涉及辅助因子eIF4E识别靶m RNA的帽子结构;microRNA和靶m RNA局限于细胞质内的PB (processing bodies) 结构内, 他们推测这是翻译抑制的结果, 且PB结构内可能还存在靶mRNA的降解机制, 以此来解释microRNA介导翻译抑制外仍然出现的少量靶mRNA降解现象;此外还发现不同物种或不同microRNA的干扰途径有所不同, 可能需要建立更完善的模型解释这种多样性。

此外, Dicer酶发挥作用时对底物的要求, RNAi过程在细胞内作用的具体位置, Drosha如何识别micro RNA, RNAi信号细胞间运动的机制, 转录抑制和翻译抑制的机制等都还不十分清楚。但可以相信随着研究程度的不断深入, RNAi机制能更清晰地展现在我们面前, 为我们科学地掌握和应用这门技术提供更坚实的理论基础。

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RNA干扰技术的研究及进展 篇3

【摘要】RNA干扰是近几年兴起的一种新技术，它是由双链核糖核酸引起的抑制基因表达的一种现象。这种新技术在抗病毒、抗癌症和基因病等医学领域表现出了广阔的应用前景。本文就RNA干扰的作用机制 、研究进展进行综述。

【关键词】RNA干扰技术 基因沉默 研究进展

【中图分类号】R9145 【文獻标识码】B【文章编号】1004-4949（2015）03-0645-01

RNA 干扰（RNA interference，RNAi）是近年来发现的一种高效特异地阻断基因表达的新技术。RNAi 是指一些小的双链 RNA（dsRNA）在细胞内 Dicer 内切酶的识别、结合、酶切下，产生有活性的长度为 21～23nt 干扰性 RNA（short interfering RNA ，siRNA），与互补的目的基因的 mRNA 结合并使之降解，从而到达抑制目的基因表达的作用，是一种由双链 RNA诱发的“基因沉默”现象。本文旨在讲述RNA干扰的作用机制及研究进展。

1.RNA干扰技术的作用机制

RNAi是指细胞中导入与内源性mRNA编码区某段序列同源的双链 RNA （double—stranded RNA，dsRNA）片段，可致该mRNA发生特异性降解从而导致基因表达沉默的现象[1]。其作用机制是：外源性 （如病毒）或内源性的dsRNA在细胞内与一种具有dsRNA特异性的RNA酶Ⅲ内切核酸酶 （RNaseUIendnuclease）——Dicer结合为酶dsRNA复合物 ，随即被切割成21～23nt的RNA片段 ，即siRNA。siRNA与 Dicer形成 RISC。siRNA 作为引导序列，按照碱基互补原则识别靶基因转录出的mRNA，并引导RISC复合体结合mRNA.随后siRNA与mRNA在复合体中换位，核酸酶 Dicer将mRNA切割成21～23nt的片段 ，从而可以破坏特定目的基因转录产生的mRNA，使其功能沉默，即基因沉默（gene silencing）。而新产生的siRNA片段可再次与Dicer酶形成RISC复合体 ，介导新一轮的同源mRNA降解 ，从而产生级联放大效应 ，显著增强了抑制基因表达的作用

2.RNA干扰技术的临床应用与进展

2.1抗肿瘤治疗

2.1.1白血病的治疗 化疗在恶性肿瘤的治疗中具有重要地位。很多学者致力于利用RNA干扰技术治疗肿瘤，以解决多重耐药性导致化疗失败的问题。例如，w0hlbold等[2]构建了针对bcr—abl融合位点 b3a2的同源siRNA，研究结果表明特异性siRNA可以使过表达 bcr—abl蛋白的细胞系（32Dp2102wt，M07P210，CD34 十 2CML细胞 ）的bcr—abl蛋白形成组显著下降，并且长期用这种特异性 siRNA可以逆转 bcr—abl蛋白依赖性的细胞循环调节作用而且可以选择性地抑制细胞生长，为进一步探索慢性粒细胞白血病治疗的新途径提供了有利的实验依据。

2.1.2治疗乳腺癌 乳腺癌细胞在体内具有不受控增殖性，有研究表明利用RNA干扰技术抑制可能导致乳腺癌的基因从而达到控制乳腺癌细胞的增殖，Jiang等[3]通过构建靶向 MTA1 （ metastasis associate d-1）的短发夹RNA（ short hairpin RNA，shRNA） 并导入ER（ +） MCF-7 和 ER（ -） MDA-MB-231 乳腺癌细胞。MTA1 下调后 ER（ -） MDA-MB-231 细胞重新表达 ERα，增加了内分泌治疗的敏感性。同时降低基质金属蛋白酶-9 （ matrix metalloproteinase-9，MMP-9） 和 cyclin D1 的蛋白表达水平，使MDA-MB-231 细胞阻滞在G0/ G1期，但对MCF-7 细胞的细胞周期无明显影响。靶向 MTA1 沉默能明显引起两种乳腺癌细胞增殖和转移抑制，RNA 靶向干扰 MTA1 基因可能具有乳腺癌治疗效用。 Qiu等 [4]实验研究表明，利用 siRNA的方法靶向沉默 cripto一1基因的表达可在一定程度上抑制人乳腺癌MDA—MB468细胞的侵袭，进而抑制肿瘤的进一步发展。另外，乳腺癌50% 的首发性和 80% 的复发性转移发生在骨骼中，Guo等提出靶向 BMP4 信号通路将成为乳腺癌治疗的新手段，实验中通过成功构建靶向BMP4的siRNA并导入MCF-7 和MBA-MD-231细胞中，抑制了癌细胞的侵袭和转移，证明了 BMP4 在乳腺癌细胞中的作用； 同时发现 MMP-1 和 CXCR4 的表达在 BMP4过表达的细胞中激增。

2.1.3其他肿瘤 肿瘤细胞可持续增殖，Zhou等[5]利用腺病毒介导的 RNAi转染人食管鳞状细胞癌细胞 Hecl能抑制腺癌肿瘤的生长和增殖并使其失去致瘤性。应用慢病毒介导的RNA干扰技术将Akt1沉默，并成功转入胃癌细胞株SGC-7901和BGC-823， 结果也发现， Akt1沉默在体外和体内环境下均可显著抑制胃癌细胞增殖并诱导细胞凋亡。钟英强等研究发现，siRNA靶向沉默 hTERT基因的表达，可在一定程度上抑制人胰腺癌 Capan-2细胞 Bcl-2、环氧化酶 2基因的表达，从而抑制肿瘤进一步恶化[6]。在前列腺癌研究领域中，金鹏等[7]已率先采用RNA干扰技术， 将针对GSTP1设计的短发卡RNA转染人前列腺癌细胞株Du145介导GSTP1基因沉默， 发现能明显抑制癌细胞增殖。

2.2抗感染

RNA技术同样可以用于病毒、寄生虫甚至细菌引起的感染性疾病中，尤其是对抗病毒情有独钟，起初是在植物中发现 RNAi的抗病毒作用，后来在动物中也发现相同的作用。近几年RNA干扰机制在抗病毒感染的研究中取得了很大进展。在病毒复制时，tat基因转录所必需的周期蛋白（cyclin）T1能够显著提高病毒基因表达水平。通过 RNAi的方法设计抑制 cyclinT1的表达 ，从而达到抑制病毒复制的目的。Deng等科学家致力于这方面的研究，最后的研究结果表明shRNA能够阻断乙型肝炎病毒DNA的表达与复制[8]。

2.3心脑血管疾病

2.3.心血管病 高血压是最常见的心血管病，张敬群等[9]通过构建两肾一夹高血压大鼠模型用携带U6启动子和血管紧张素1受体短发夹RNA编码序列的质粒干扰AT1a受体，结果证实可有效抑制肾血管性高血压进展。在心肌病及心力衰竭的研究也有一定进展，李凡东等[10]通过RNA干扰IK1表达，使其电流幅度明显下降，有利的抑制了心机细胞IK1，為治疗心肌病提供了新的方法。Watanabe等[11]将肌浆网Ca2+ATP酶（SERCA2a）的RNA转染入新生小鼠心肌细胞，通过证实SERCA2a的mRNA和蛋白水平显著下降，而钙离子的吸收明显提高。杨广等[12]也在实验中进一步验证了RNA可干扰心衰大鼠受磷蛋白mRNA的表达，改善心脏功能。

2.3.2脑血管病 2.脑血管疾病致残率、致死率极高，治疗脑血管病成为了又一个研究重点。基因靶点治疗主要体现在动脉粥样硬化方面。脂蛋白脂肪酶（LPL）在动脉粥样硬化中的机制不完全清楚，因此脂蛋白脂肪酶成为治疗动脉硬化的突破口。刘明等[13]利用 RNAi 技术在细胞水平抑制LPL 基因的表达，结果证实抑制率可达 70%以上。这一结果为以后控制和预防脑血管疾病提供了理论依据。洪涛等[14]应用 RNAi 技术沉默平滑肌细胞间隙连接蛋白 43（ connexin43，Cx43）的表达，从而抑制了细胞间的通讯。在此基础上，他们继续采腺病毒介导的RNAi特异干扰脑血管痉挛 Cx43 的异常高表达，进一步证实 Cx43 及缝隙连接在脑血管痉挛发生、发展中的重要作用，也为探讨脑血管疾病的基因治疗做出贡献。

2.4其他

还可用于遗传病的研究中， RNAi在基因功能和相关方面的研究中具有许多传统方法无法比拟的优势 ，因此许多遗传学家和分子生物学家对此产生了极大兴趣，RNA干扰技术成为了遗传学研究的新方法。实验研究发现，在体内siRNA能够直接作用于点突变的基因使其功能丧失降低突变，野生型基因却不受影响，因为点突变引发的遗传性疾病能够通过应用 RNAi技术降低突变方法进行治疗。例如 ，遗传性神经系统退化性疾病Huntington病和 Alzheimer病的治疗就可以通过RNAi技术，即在脑部局部注射siRNA进行基因治疗；再如应用 RNAi技术治疗常染色体显性色素性视网膜炎 （adRP）的转基因小鼠，取得了良好的效果。

3.研究进展

siRNA 的这种非特异性反应和 RNA 传递效率极大地影响着它的体内应用，但进一步合理设计高效 siRNA 序列、开发在体内具有长效功能的载体、完善更为特异性的体内输送途径等将成为进一步促进 RNAi 作为疾病治疗策略的研究热点。随着 RNAi 机理的进一步阐明，RNAi 技术将以惊人的速度向前发展，不断取得突破，联合多基因 RNAi 治疗也将为基因治疗开辟更广阔的前景。总之，随着RNA干扰机制研究的深入和完善，应用RNA干扰技术，必将大力推动人类疾病的治疗和人类功能基因组学的发展。

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