超声背向散射积分技术 篇1
1 材料与方法
1.1 糖尿病大鼠模型的制备及分组
8周龄SPF级健康雄性SD大鼠50只(购自北京维通利华实验动物中心),体重180～210 g,平均(199.64±11.04) g。抽签法随机选取32只按65 mg·kg-1腹腔注射链尿佐菌素(streptozotocin,STZ,Sigma公司)。注射后3 d及7 d,断尾法用ACTIVE血糖仪(上海罗氏医药公司)测血糖,将血糖稳定大于16.7 mmol·L-1、尿糖持续阳性者定为糖尿病大鼠模型(DM组)。除去未成模4只及死于急性并发症大鼠10只,余下的18只随机分为4、12、24周组,每组6只,同时随机选取同周龄大鼠各6只作为正常对照(CN)组。
1.2 超声检测
大鼠腹腔注射10%水合氯醛(350 mg·kg-1)麻醉后取左侧卧位,应用HP-SONOS- 5500超声诊断仪,S8探头,于M型超声下检测左心室波群并测量大鼠左室舒张内径(Dd)、收缩末期内径(Ds),计算左室射血分数(LVEF)。启动声学密度(AD)定量系统,调节深度(2～3 cm)、总增益、时间补偿增益及侧方增益补偿,获得满意的左室长轴及乳头肌水平左室短轴切面,将连续2.48 s内62帧图像存入磁光盘。感兴趣区(ROI)置于左室后壁中间段的心肌层及心腔内,随心动周期运动。测得以下参数:峰-峰强度(PPI,即背向散射积分周期变化值,CVIB),平均图像强度(AII,即IBS),图像背向散射标准差(SDI)。心肌校正IBS(IBS%)=心肌层IBS值/心腔血流IBS值。
1.3 标本采集
腹主动脉放血处死动物,立即取左室心尖部1 mm×1 mm×2 mm左右心肌组织2块,放入2.5%戊二醛中,保存于4 ℃冰箱,用于电镜观察。将心脏自心尖部至心底部横断为3份,取中间段放入10%中性福尔马林中固定,做好标记,用于组织形态学观察(Masson三色染色、免疫组织化学染色),另2份放入做好标记的冻存管中,并立即投入液氮中,然后转移至-70 ℃冰箱,用于心肌羟脯氨酸(HPC)检测。
1.4 心肌HPC浓度测定
试剂盒购自南京建成生物技术公司。碱水解法进行前处理,用722可见分光光度计测550 nm处各管吸光度值,计算HPC。
1.5 Masson三色染色法进行胶原染色
应用Masson三色染色法对心肌进行染色(试剂盒购自福州迈新生物技术公司),胶原纤维呈蓝色,心肌细胞呈红色。用图像采集系统(Olympus公司)采图,Motic Med数码医学图像分析系统计算心肌胶原容积分数(CVF)和血管周围胶原面积(PVCA)。CVF=胶原面积/总面积,其中胶原面积不包括血管周围胶原面积;PVCA=壁内小动脉管腔周围胶原面积/该小动脉管腔面积。每组取12张切片,每张切片随机取5～10个200倍显微视野图像。
1.6 免疫组化染色测定胶原蛋白Ⅰ和Ⅲ的表达
石蜡切片,TGF-β1采用柠檬酸高压抗原修复,胶原蛋白Ⅰ和胶原蛋白Ⅲ采用复合消化液酶修复,分别滴加抗兔胶原蛋白Ⅰ和Ⅲ(武汉博士德生物制品公司)稀释一抗(1∶100),放入4 ℃冰箱过夜。再滴加生物素化山羊抗兔IgG和试剂SABC,DAB显色。每组取12张切片,每张切片随机取10～15个200倍显微视野图像,测定平均积分光密度(intergrated optical density,IOD)。
1.7 透射电镜标本制备
心肌组织脱水,浸透聚合。行超薄切片并用2%醋酸铀及枸橼酸铅染色,透射式电子显微镜(日立H- 7650)观察摄片。
1.8 统计学分析
所有数据均以undefined表示,应用SPSS 12.0软件包进行统计学分析。各组间比较采用随机区组设计的方差分析,相关性用线性相关分析。
2 结 果
2.1 大鼠一般情况观察
与CN组比较,DM组明显消瘦,多饮、多尿,精神萎靡,活动减少,毛发枯黄、无光泽,第6周出现白内障。
2.2 超声指标变化
各组大鼠LVEF未发现明显差异(P>0.05)。IBS% DM组明显高于CN组(P<0.05),且随鼠龄增加逐渐升高,见表1。CVIB和IBS 12周时未见明显差异(P>0.05);24周时CVIB CN组为6.3,DM组明显降低(4.1),IBS CN组为18.7,DM组明显升高(22.5),两组比较均有显著性差异(均P<0.05)。见图1。
注:LVEF为左室射血分数,IBS%为校正背向散射积分,CVIB为背向散射积分周期变化值,HPC为羟脯氨酸,CVF为心肌胶原容积分数,PVCA为血管周围胶原面积与CN组比较,* P<0.05;与DM 4周组大鼠比较,△P<0.05,与DM 12周组比较,#P<0.05
2.3 HPC测定和Masson染色胶原形态定性分析
HPC含量DM组明显高于CN组(P<0.05)。Masson染色各CN组胶原主要沉积在小动脉外膜,在心肌间质中较少;DM组血管周围胶原增密,在心肌间质中明显增多。DM组大鼠的CVF、PVCA均显著高于CN组(均P<0.05)。见图2。
2.4 心肌组织中胶原蛋白Ⅰ和Ⅲ的表达
DM组Ⅰ型胶原主要在细胞间质呈线状分布,随病程进展表达呈束状;Ⅲ型胶原主要在细胞间质和胞浆分布,在血管平滑肌细胞亦有表达,横切面上多表现为散在的斑块。与CN组比较,DM各组表达均明显增加(P<0.05)。见图3、4。
2.5 超微结构观察
CN组心肌细胞肌原纤维丰富,肌丝排列整齐,线粒体嵴排列有序,可见成纤维细胞和少量胶原微纤维。DM组肌原纤维含量明显减少,肌丝断裂甚至溶解消失;线粒体肿胀,代偿增多,嵴断裂甚至空泡化;间质内成纤维细胞增生,大量胶原微纤维成束出现,随时间延长进展逐渐加重。见图5。
2.6 相关分析
IBS%与MF指标HPC(r=0.736)、CVF(r=0.758)、PVCA(r=0.747)、胶原蛋白Ⅰ(r=0.782)、胶原蛋白Ⅲ(r=0.677)呈正相关(P<0.000 1)。CVIB与HPC(r=-0.449)、CVF(r=-0.548)、PVCA(r=-0.509)、胶原蛋白Ⅰ(r=-0.595)、胶原蛋白Ⅲ(r=-0.281)呈负相关(P<0.01),与胶原蛋白Ⅲ(r=-0.281)虽呈负相关(P=0.096 3),但无统计学意义。
3 讨 论
糖尿病MF最主要的病理改变为间质中胶原沉积过多,各型胶原比例失调(Ⅰ/Ⅲ型胶原比例增加)和排列紊乱。胶原大量沉积,造成心室壁僵硬度增加,心室顺应性降低致心室舒张与收缩功能不全。本实验应用大剂量一次性腹腔注射STZ,破坏大部分胰岛β细胞功能,致胰岛素绝对缺乏,血糖快速升高,并维持高水平,类似人类1型糖尿病发生、发展过程。比较各时间段超声IBS%、CVIB的变化趋势,结合病理学观察MF改变,为应用超声早期诊断糖尿病心肌病变提供理论依据。
正常心肌组织中胶原含量(CVF)在大鼠为3%～5%[2]。正常情况下左心室约有2 000万个心肌细胞,心肌细胞坏死超过750万并被胶原纤维取代,心功能即失代偿,这可能是导致心力衰竭的病理基础。迄今为止,已知成年动物和人类心肌组织中胶原至少有5种类型,即Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ型。各型胶原的相对比例在不同种属动物的心肌中有些差异,但都以Ⅰ、Ⅲ型为主。Ⅰ型胶原纤维粗大,互相融合,排列致密,主要分布于心内膜、心瓣膜、心外膜、肌束膜和大血管壁外层,抗拉强度高,而伸展性和回缩性小,决定心肌舒张收缩的僵硬度;Ⅲ型胶原纤细,呈细网状排列,主要分布于心肌细胞之间、小血管周围间隙及心外膜下,伸展性和回弹性较大。两型胶原往往同时存在,在生理状态下,处于不断合成和降解的动态平衡中,随着年龄增长,代谢减慢,组织胶原量逐渐增多;但在病理条件下,二者转换失衡,导致心肌间质纤维化。
本实验结果显示,DM组12周和24周组胶原含量均显著高于CN组,表明早期即出现胶原的增生。且主要是Ⅰ型胶原在细胞间质的广泛、弥漫性表达并进行性增多,使DM大鼠心肌僵硬度增加,这与文献[2]报道一致。Ⅲ型胶原表达先有增加,24周后减少。因HPC在胶原中含量较恒定(12.7%),故本研究应用HPC反映心肌胶原总含量。Masson定性分析显示自第4周起,DM组胶原含量明显高于CN组,这是DCM的直接证据。超微结构亦可见DM组随病程延长心肌间质内成纤维细胞增生,大量胶原微纤维成束出现。
IBS技术是近年来发展起来的无创超声诊断技术,通过探测组织的声学参数来定量描述正常和病理组织的特性,从而评价与分析组织病理结构的类型和程度[3]。IBS偏重于反映静力学(如MF、水肿、坏死等)变化,而CVIB偏重于反映动力学(与心肌收缩力相关的如肌节长度、肌纤维方向等)变化,与收缩功能有关[1]。国外学者[4,5,6]也发现CVIB值随着心肌收缩力的变化而变化,一旦CVIB值发生了明显改变,也就表明心肌组织的收缩功能发生了改变。因为IBS值与心肌纤维方向与超声束之间的夹角有关,显示了声学特征的角度依赖性。平行时散射最小,垂直时散射最大,在左心室长轴和短轴切面的前间隔和后壁可获得稳定的IBS和CVIB,而在其他切面及其他室壁心肌变异较大。因此,本试验以左室后壁作为观测点。
本实验IBS显示,自4周起DM组IBS%较同期CN组显著增高,随病程延长逐渐升高。可能系DCM大鼠心肌细胞及血管周围胶原纤维增多,造成散射原排列紊乱,ROI区散射原密度增多,从而引起IBS增加。相关分析显示,IBS%与MF指标HPC、CVF、PVCA、胶原蛋白Ⅰ和Ⅲ的表达呈正相关,可以用来评价MF,IBS技术可以用来反映DCM不同发展阶段心肌的组织学损伤。同时也说明在高血糖环境中4周已出现胶原纤维增多,IBS可以早期发现这种变化,是较敏感的指标。CVIB在第4周时尚无明显变化,12周时有所下降,但未有统计学意义,第24周LVEF尚处在正常范围时,CVIB可见明显下降,说明在24周时DCM大鼠心肌收缩功能储备已下降。与苗雅等[7]报道的结果类似。超微结构显示,肌丝的大量丢失必然导致心肌收缩功能降低,线粒体增生表明能量代谢紊乱,可致心肌顺应性降低。其机制可能为:糖尿病使机体能量代谢障碍,心肌纤维化,致其僵硬度增加,顺应性减低;细胞及血管周围纤维增多可影响心肌兴奋性及传导,并使氧的弥散距离加大从而增加心律失常、心肌缺血的危险性,使心功能下降。因糖尿病心肌病早期无临床症状和体征,临床上有明确的早期诊断是困难的。若在亚临床阶段利用IBS技术即得到诊断并客观评价左室功能,早期采取有效措施防止心脏功能进一步受损,对延缓DC的发展及改善预后将有重要意义。
综上所述,胶原蛋白Ⅰ持续性增加是DCM模型鼠MF的主要原因。IBS%可以早期发现DCM,并监测MF程度。通过对CVIB的监测,可以反映中晚期DCM心肌收缩功能的储备。IBS技术有望成为临床上评价MF的重要方法。
参考文献
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