产甲烷生物阴极 篇1
1 瘤胃产甲烷菌的分类
《伯杰氏细菌鉴定手册》 (第8版) 中将产甲烷菌归属于1科、3属、9种, 截止至1992年发展为3目、7科、29属、70种, 截止至2009年发展为4目、12科、31属。研究发现, 从系统发育看, 产甲烷菌可分为5个目, 即甲烷杆菌目、甲烷球菌目、甲烷八叠球菌目、甲烷微菌目和甲烷超高温菌目, 到目前为止瘤胃内发现的产甲烷菌主要集中在前4目。产甲烷菌是古生菌门中的一类专性厌氧菌[3,4], 这类细菌的数量在瘤胃液中的变动范围为1×107~1×109/m L, 受日粮组成影响较大。此外, 所有的产甲烷菌含有辅酶F420, 它充当甲酸脱氢酶和氢化酶成为参与甲烷生产的一个辅助因子。由于对氧极度敏感, 大多数细菌的生存和成长只能在严格厌氧环境下, 需要底物如氢、甲酸、甲醇、甲胺、乙酸等[5]。反刍动物产甲烷是能量的重要损失[6]。在5种产甲烷菌目中, 甲烷杆菌目在瘤胃中数量大, 占有优势。利用荧光原位杂交技术 (FISH) 和产甲烷菌目特异性探针技术研究发现, 甲烷球菌属占44%, 甲烷杆菌属占37%, 甲烷微菌属占16%, 甲烷八叠球菌属占3%。然而, 仅产甲烷菌的7个物种 (Methanobacterium formicicum、Methanobacterium bryanti、Methanobrevibacter ruminantium、Methanobrevibacter smithii、Methanomicrobium mobile、Methanosarcina barkeri、Methanoculleus olentangii) 可以从反刍动物和非反刍草食动物体外培养获得[6]。
2 分子生物技术在瘤胃产甲烷菌中的应用
1990年, Giovannoni等人首先通过16S rRNA序列对海面马尾藻浮游微生物的多样性进行分析, 自此分子生物技术迅速在来源于不同微生物群落包括瘤胃微生物群落的研究中得到迅速推广和改进。分子生物技术的运用以16S/18S rRNA/DNA序列为基础, 除荧光原位杂交技术外, 目前其余分子生物技术方法需要从瘤胃样品中提取DNA/RNA进行分子分析。在使用分子生物技术分析时, 研究者所要解决的第一个问题为样品的采集。由于瘤胃微生物数量变化受日粮影响较大, 不同的采食时间和瘤胃中不同部位采集的样品对微生物的定性和定量分析结果影响较大, 此外同样需要考虑的是采集样品时所采用的方法。采集到的瘤胃样品经过DNA提取, 获取总瘤胃DNA, 以总瘤胃DNA对瘤胃微生物定性、定量及生物多样性分析, 通过PCR仪进行PCR扩增, 扩增后的DNA通过变性梯度凝胶电泳 (DGGE) 、温度梯度凝胶电泳 (TGGE) 、单链构像多态性分析 (SSCP) 、限制性片段长度多态性分析 (T-RFLP) 、核糖体基因间隔区分析 (RISA) 等分子标记方法建立指纹图谱[7], 再进一步对微生物群落进行定性和多样性测定。此外, 总瘤胃DNA和扩增后的DNA可通过实时荧光定量PCR分子分析法对瘤胃微生物进行定量分析, 而荧光原位杂交技术所需要的样品不用通过提取DNA这一步骤就可以对瘤胃微生物进行定量分析。瘤胃微生物群落分子分析方法流程见图1。
3 产甲烷菌在瘤胃微生物区系中的相互关系
3.1 细菌
在不同瘤胃微生物中, 瘤胃细菌特异性最大, 1 m L瘤胃液中革兰阴性菌和革兰阳性菌的含量可达到1×1011[3], 大多数都是专性厌氧菌, 通过不同酶活力参与分解饲料中木质素和纤维素。除了纤维素分解菌外, 瘤胃中还有分解蛋白、脂肪、淀粉等细菌[8]。在不同细菌属中, 琥珀酸丝状杆菌、黄色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌是纤维素和半纤维素的主要消化细菌[9]。有趣的是, 这些细菌仅占瘤胃细菌总数的0~4%。产乙酸菌也存在于瘤胃液中, 含量为0~1×105/m L[10], 通过产生醋酸盐扮演耗氢作用。
3.2 真菌
厌氧真菌在反刍动物或草食动物的胃肠道中分布广泛, 产生不同的水解酶, 进而对消化纤维起重要作用[11]。由于专性厌氧菌体外培养处理困难, 因此对于厌氧真菌的了解和认识依然受到很多限制。目前, 反刍动物厌氧真菌仅6目被报道, 按照单多着丝类型分类, 这些真菌占瘤胃微生物组成总量的8%~20%。
3.3 原虫
原虫包括鞭毛虫和纤毛虫, 纤毛虫是瘤胃中一种常见微生物, 占瘤胃活生物量的50%左右 (1×104~1×106/m L) 。瘤胃中约有42种原生动物被描述出来。瘤胃纤毛类原生动物根据形态特征被分成全毛目的原生动物群 (Isotricha、Dasytricha) 和entodiniomorphid (Entodinium、Diplodinium、Eudiplodinium Ostracodinium、Metadinium、Enoploplastron、Polyplastron、Epidinium、Ophryoscolex) 。纤毛原生动物与产甲烷菌建立了内外共生关系[12]。试验证明, 消除瘤胃内原生动物有益于细菌和真菌群清除氧气、调节微生物总数、减少甲烷生成, 同时帮助菌体氮转移给反刍动物并被其消化和利用。
3.4 噬菌体
噬菌体在瘤胃中的含量巨大, 在瘤胃液中数量变化范围为1×109~1×1010粒/m L。从形态学上分类, 可分为3种滤过性病毒性属朊病毒科、长尾病毒科和短尾病毒科, 其中26~40种已经被报道[13]。在瘤胃细菌和产甲烷菌的种群动态中, 噬菌体对维持瘤胃微生物区系的动态平衡有重要作用。由于寄主专一性和溶菌活性使这些噬菌体的基因成为研究甲烷减缓措施的重要来源。然而, 更多的研究着力于发现产甲烷菌体内特定的噬菌体。
4 基于瘤胃内氢离子调控对产甲烷菌的影响
在瘤胃微生物中, 有些菌发酵产生氢, 称产氢菌, 如黄化瘤胃球菌和白色瘤胃球菌等细菌, 以及瘤胃厌氧真菌;有些菌可以利用氢进行生长和代谢, 产生新的产物, 这类菌称为耗氢菌, 主要是产甲烷古菌。这种氢从一种菌的产物转移给另一种菌的产物的现象被称为种间氢转移。瘤胃中其他微生物产生的氢可很快被甲烷细菌转化成甲烷。据Hungate报道, 1头体重为500 kg的奶牛每天可产生近800 L氢气, 在瘤胃中气相部分只有很微量的氢气存在, 绝大部分氢被用于生成甲烷, 因此瘤胃内氢分压很低。
4.1 产氢菌与产甲烷菌的关系
4.1.1 纤维分解菌与产甲烷菌
纤维分解菌在瘤胃微生态系统中具有中枢作用, 绝大多数纤维分解菌为产氢菌, 其主要代谢产物为氢;抑制甲烷生成会引起氢的积累, 从而抑制细菌细胞内氧化还原过程中辅酶的再氧化, 最终抑制纤维降解。因此, 在抑制甲烷产生的同时, 还得保证纤维物质的降解能力不受影响。研究发现, 许多动物瘤胃中纤维分解菌数量和甲烷菌数量呈正相关, 包括牛、绵羊、鹿、美洲驼和马 (盲肠) 等, 尽管绝大多数纤维分解菌发酵过程产生氢, 但也有部分细菌不产氢。F.Chaucheyras-durand对羔羊瘤胃微生物进行处理, 将产氢的瘤胃球菌、真菌和不产氢的纤维分解菌分开, 取其瘤胃内容物进行培养, 结果发现, 在含有产氢纤维分解菌的体外培养物中生成的甲烷较不含产氢纤维分解菌的多。可见, 促进不产氢纤维分解菌的生长, 不仅不影响瘤胃中纤维素的分解, 同时也能减少甲烷的生成。因此, 促进瘤胃不产氢纤维分解菌的生长可能是降低氢继而降低甲烷, 同时保证纤维分解菌活性的新途径。
4.1.2 瘤胃原虫与产甲烷菌
瘤胃原虫中纤毛虫个体最大、数量最多, 且最为重要, 反刍动物成年后体内的主要原虫类群以纤毛虫为主。专家们采用各种理化手段去除原虫, 研究其对瘤胃功能的作用。瘤胃中纤毛虫的数量和甲烷产量有直接关系, 一些降低甲烷排放的措施在一定程度上对原虫的生长有抑制作用。原虫促进甲烷产生所涉及的机制很多, 由于原虫与部分产甲烷菌有着内外共生关系, 其原虫产生的氢为产甲烷菌提供了底物, 此外也可保护产甲烷菌免受氧的毒害, 在这个过程中产甲烷菌和原虫都是受益者。氢及时被利用掉, 使有机物发酵正常进行, 发酵过程中瘤胃内丁酸和乳酸减少, 生成大量的乙酸和二氧化碳, 这样原虫产生ATP的效率得到提高。
4.2 耗氢微生物与产甲烷菌的关系
4.2.1 延胡索酸利用菌与产甲烷菌
延胡索酸是生物体新陈代谢过程中三羧酸循环的中间代谢产物。延胡索酸利用菌可将延胡索酸还原成琥珀酸, 进而形成丙酸, 这个过程消耗氢, 因此延胡索酸利用菌也是耗氢菌。研究证实, 延胡索酸可以促进延胡索酸利用菌 (如产琥珀酸丝状杆菌、产琥珀酸弧杆菌、产琥珀酸沃林菌等) 的生长, 从而与产甲烷菌竞争底物氢和甲酸, 抑制产甲烷菌的生长, 导致瘤胃内产生的甲烷减少。Wood等人用羔羊进行试验, 结果发现, 包被延胡索酸可使甲烷产量降低76%。在以粗料为底物的连续发酵系统中, 添加315 g/L延胡索酸后, 甲烷产量降低38%。另外, 延胡索酸钠在降低甲烷产量的同时也不影响纤维消化率, 可作为替代甲烷的一种理想电子受体。Asanuma等人报道, 在瘤胃已培养的细菌中, 产琥珀酸丝状杆菌、反刍兽新月形单胞菌、极小韦永球菌和产琥珀酸沃林菌等具有较高的延胡索酸还原活性。瘤胃中延胡索酸还原菌的多样性和富集培养也是近些年的研究热点。
4.2.2 产乙酸菌与产甲烷菌
产乙酸菌也可将氢作为营养物质通过还原二氧化碳合成乙酸, 如Eubacterium limosum和Acetitomaculum ruminis[14]。瘤胃产生的乙酸是反刍动物能量的主要来源, 而且产乙酸菌与产甲烷菌的竞争性利用氢是一个自然、安全的过程。因此, 一些学者希望能通过在瘤胃内建立乙酸菌优势生长的微生态环境抑制产甲烷菌的生长, 从而减少甲烷的生成。目前, 普遍的方法是添加还原性乙酸菌, 以建立新的瘤胃微生态平衡。由于还原性乙酸菌是主要的电子受体, 而很多非反刍草食动物体内甲烷排放量的降低常伴随着乙酸产量的提高, 这种现象促使学者对还原性乙酸产生的途径进行深度研究。反刍动物出生后20小时瘤胃中首先建立起还原性乙酸菌菌群, 然后再次建立产甲烷菌菌群。G.Fonty等[15]报道, 反刍动物出生后1~3 d内就可检测到甲烷菌, 当产甲烷菌数量增加到成年动物体内数量时, 还原性乙酸菌数量降低。在成年动物瘤胃内, 还原性乙酸菌的密度范围为1×103~1×107/g, 其还原性乙酸菌数量受日粮和培养计数技术的影响, 但它们比产甲烷菌的数量少10倍。还原性乙酸菌难以与产甲烷菌竞争的另一个原因可能是前者从氢的氧化过程中获得能量的效率和对底物的亲和力较低, 而底物阀值又较高。
5 总结与展望
产甲烷生物阴极 篇2
同时产甲烷反硝化颗粒污泥中微生物群落结构
摘要：在UASB成功运行同时产甲烷反硝化小试基础上,针对反应器内颗粒污泥,通过构建古菌和细菌的16S rDNA基因文库、RADAR遗传变异分型和测序比对等技术进行了微生物系统发育关系和群落结构分析.结果表明,在颗粒污泥的古菌中,产甲烷髦毛菌和产甲烷杆菌是主要菌群,随机选出的88个古菌克隆子,这两类古菌的.16S rDNA序列分别占古菌总量71.59%和22.73%;而颗粒污泥中细菌的多样性要高于古菌,低GC革兰氏阳性菌和ε变型菌纲分支的细菌是细菌的主要菌群,在随机选出的133个细菌克隆子中,这2类细菌的16S rDNA序列分别占细菌总量的49.62%和12.03%.作 者：孙寓姣 左剑恶 陈莉莉 SUN Yu-jiao ZUO Jian-e CHEN Li-li 作者单位：清华大学环境科学与工程系,北京,100084 期 刊：中国环境科学 ISTICPKU Journal：CHINA ENVIRONMENTAL SCIENCE 年，卷(期)：, 27(1) 分类号：X7 关键词：同时产甲烷反硝化 颗粒污泥 16S rDNA基因文库 群落结构