ORF136基因三篇

ORF136基因 篇1

本研究以国内首次分离得到的锦鲤疱疹病毒吉林株 (KHV-CJ) 基因组为模板, 成功克隆得到KHV主要囊膜蛋白基因 (ORF136基因) , 并分析了其生物学信息, 旨在为我国KHV的基因背景信息、发病机理、分子流行病学及基因工程疫苗的研究奠定基础。

1 材料

1.1 毒株与细胞

KHV-CJ, 由吉林农业大学重点实验室分离保存[4];锦鲤尾鳍细胞, 由吉林农业大学重点实验室培养保存。

1.2 载体与菌株

p MD18-T载体, 购自宝生物工程 (大连) 有限公司;E.coli DH5α感受态细胞, 购自北京全式金生物技术有限公司。

1.3 主要试剂

新生牛血清、M199培养基, 购自GIBCO公司;Ex Taq DNA聚合酶、限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ、DNA Marker, 购自宝生物工程 (大连) 有限公司;DNA胶回收试剂盒, 购自天根生化科技 (北京) 有限公司;其他试剂均为国产分析纯。

2 方法

2.1 引物的设计与合成

根据Gen Bank登录的KHV ORF136基因序列, 应用Primer Premier 5.0软件设计1对引物。引物序列:上游引物P1 5'-GAATTCATGAAGGCCTCTA-AACTGC-3' (下画线部分为EcoRⅠ酶切位点) , 下游引物P2 5'-AAGCTTTTAGATTTTTCTAAAGTG-CACG-3' (下画线部分为HindⅢ酶切位点) , 送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

2.2 KHV-CJ ORF136基因的扩增

参照参考文献[5-6]中的方法培养细胞。将KHV-CJ接种到鲤鱼尾鳍单层细胞上, 每日观察细胞的病变情况, 当细胞病变达到70%~80%时收集病毒, 按照常规方法提取病毒DNA, PCR反应条件:95℃预变性5 min;94℃变性30 s, 58℃退火30 s, 72℃延伸1 min;共35个循环;最后72℃再延伸10 min;反应结束后于4℃保存, 备用。

2.3 KHV-CJ ORF136基因的克隆与鉴定

纯化回收目的基因后与p MD18-T载体于4℃过夜连接, 将连接产物转化到E.coli DH5α感受态细胞中, 用含1μg/m L氨苄西林的LB固体培养基筛选单个菌落, 提取质粒后用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定, 将阳性质粒命名为p MD18T-ORF136, 并送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

2.4 KHV-CJ ORF136基因的生物信息学分析

通过Prot Scale在线分析ORF136基因的疏水性, 用TMHMM Server v.2.0软件预测ORF136基因的跨膜区, 分别利用Net NGlyc1.0和Yin OYang1.2在线分析软件预测ORF136基因的N-糖基化位点和O-糖基化位点, 并用BLAST比对分析ORF136的测序结果, 再与Gen Bank上的其他病毒株对比同源性。

3 结果与分析

3.1 KHV-CJ ORF136基因的扩增 (结果见图1)

由图1可知, 经PCR扩增得到1条长度为462 bp的条带, 与目的基因大小一致。

M.DNA分子质量标准;1.ORF136 PCR产物。

3.2 KHV-CJ重组质粒p MD18T-ORF136的鉴定 (结果见图2~3)

M.DNA分子质量标准;1.p MD18T-ORF136 PCR产物。

M.DNA分子质量标准;1.p MD18T-ORF136的双酶切产物。

由图2~3可知, 用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切p MD18T-ORF136后获得1条大小约为462 bp的片段, 说明ORF136基因已被成功加到p MD18-T载体中。

3.3 KHV-CJ ORF136基因的生物信息学分析

3.3.1 KHV-CJ ORF136基因的序列测定和编码蛋白质分子特征

测序结果表明, ORF136基因为一个完整的开放阅读框, 全长462 bp, 含153个氨基酸, ORF136的理论分子质量为16.44 ku, 等电点为7.193, 含10个强碱性氨基酸 (K、R) 、10个强酸性氨基酸 (D、E) 、67个疏水氨基酸 (A、I、L、F、W、V) 、42个极性氨基酸 (N、C、Q、S、T、Y) 。

3.3.2 KHV-CJ ORF136基因的跨膜区分析

通过TMHMM Server v.2.0软件预测ORF136基因的跨膜区, ORF136基因分别在7~29位和91~113位有跨膜区, 见290页彩图4。

3.3.3 KHV-CJ ORF136基因的疏水性分析

由Prot Scale在线分析KHV-CJ ORF136基因所编码的氨基酸序列的疏水性可知, ORF136基因的最大和最小疏水系数分别为2.344和-0.500, 见图5。

3.3.4 KHV-CJ ORF136基因糖基化位点的预测

由Net NGlyc1.0和Yin OYang1.2在线分析结果表明, KHV-CJ ORF136基因的氨基酸序列有1个潜在的N-糖基化位点和19个潜在的O-糖基化位点。

3.3.5 KHV-CJ ORF136基因的抗原表位分析

应用DNAStar 6.0软件对测序得到的核苷酸序列进行抗原表位分析, 结果ORF136基因的抗原表位都较好, 可作为基因疫苗的候选株, 见图6。

3.4 KHV-CJ ORF136基因的同源性分析

BLAST比对结果表明, KHV-CJ ORF136与KHV-U ORF136和KHV-I ORF136的同源性为100%, 与KHV-GZ11 ORF136的同源性为99% (有1个碱基发生突变) , 与KHV-GZ10 ORF136、KHV-QY08 ORF136和KHV-J ORF136的同源性均为97% (插入12个碱基) 。说明KHV-CJ ORF136与KHV-U ORF136和KHV-I ORF136的亲缘关系最近, 与KHV-GZ11 ORF136的亲缘关系较近, 与KHV-GZ10 ORF136、KHV-QY08 ORF136和KHV-J ORF136亲缘关系最远。因此, KHV-CJ可能来源于欧美国家和以色列, 可用于鉴别美国株、以色列株和日本株。

4 讨论

本试验经克隆获得长为462 bp的ORF136基因的全基因序列。通过Prot Scale在线分析KHV-CJ ORF136基因所编码氨基酸序列的疏水性, 结果表明, ORF136基因的最大和最小疏水系数分别为2.344和-0.500。Net NGlyc1.0和Yin OYang1.2在线分析结果表明, KHV-CJ ORF136基因的氨基酸序列有1个潜在的N-糖基化位点和19个潜在的O-糖基化位点[7]。蛋白质翻译后一种重要的修饰就是糖基化, 有一半以上的蛋白质在翻译完成后进行糖基化修饰, 许多研究证明, 蛋白质翻译后的糖基化修饰将最终影响蛋白质的功能, 并且蛋白基因组多样性的增加也可能与此有关, 蛋白质的抗原性和免疫原性与蛋白质的N-糖基化作用位点相关[8]。

通过对KHV-CJ ORF136基因所编码蛋白的抗原表位分析表明, ORF136基因所编码蛋白的表面抗原决定簇的分布区域广泛且集中, 峰值高。表位可能是抗原分子上的一个免疫活性区, 对抗体分子或免疫细胞的表面抗原受体与表位的结合有重要作用, 也可能是蛋白质抗原性的一个基础, 为了能更好、更准确地定点改造蛋白质分子, 设计疫苗分子结构及免疫干预治疗等[9]必须对蛋白质表位图谱进行正确而详细地绘制。抗原表位分析预示, KHV-CJ ORF136基因有作为候选基因研制基因工程疫苗的潜力[10]。

参考文献

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[9]李海侠, 毛旭虎.蛋白质抗原表位研究进展[J].微生物学免疫学进展, 2007, 35 (1) :54-58.

ORF136基因 篇2

关键词：绵阳；猪繁殖与呼吸综合征；ORF5基因；克隆；遗传变异

中图分类号： S852.6文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）09-0026-04

收稿日期：2013-12-05

基金项目：四川省应用基础研究计划（编号：2013JY0127）；四川省教育厅自然科学研究项目（编号：09ZB033）；绵阳师范学院科研项目（编号：QD204A004）。

作者简介：陈希文（1977—），男，四川宜宾人，博士，副教授，从事动物疾病防控研究。Tel：（0816）2200065；E-mail：xwch05@163.com。猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是一种流行于全球的猪烈性传染病，该病于1987年在美国发现首例病例后很快就在欧美各国的猪群中引发了一场空前的“流产风暴”，使有关国家的养猪业蒙受了灾难性的经济损失。这种曾被称为猪神秘病（mystery swine disease，MSD）、猪蓝耳病（blue-eared disease of pigs）的猪病现已蔓延至世界各国，是目前造成全球养猪业经济损失严重的疾病之一[1-9]。该病的病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV），Wensvoort等在荷兰首次分离到该病毒[10]，以后在美国、加拿大、欧洲国家、中国以及日本也陆续分离到[11-13]。该病毒为有襄膜的单股正链RNA病毒，含有8个读码框，由于其基因组结构和转录机制与动脉炎病毒相似，1995年国际病毒分类委员会将PRRSV归属于动脉炎病毒科 （Arteriuiridae）动脉炎病毒属 （Arteriuirus）。2006年在中国暴发的猪高热病的主要病原就是PRRSV 变异株（高致病性PRRSV），其显著特点是高发病率和高死亡率，并引起育肥猪的发病死亡[14]。PRRSV有8个读码框，其中ORF5编码囊膜糖蛋白GP5，该蛋白是PRRSV 异质性最高的结构蛋白，2个基因型间氨基酸的相似性仅50%～55%，北美型不同分离株间GP5 的同源性为89%～94%，欧洲株间的同源性为87.10%～9925%。GP5 也是PRRSV 主要的宿主保护性抗原，参与细胞免疫和体液免疫，GP5 的变异直接导致PRRSV疫苗株的交叉保护率降低，给该病的防控带来了更大的挑战[15-18]。有研究表明，中国北美型流行毒株可被分为多个亚型，近来又有研究表明中国同时存在着欧洲型PRRSV，这些无疑给该病的防控增加了难度。本研究對四川省绵阳地区主要猪场PRRS流行毒株 ORF5基因进行了克隆和测序，并将测序获得的ORF5 序列与GenBank 中的参考毒株序列进行了比较分析，确定PRRSV 在绵阳地区猪场的遗传变异情况和分子流行病学特征，为PRRSV疫苗毒株的选择和综合防控提供了参考。

1材料与方法

1.1试验材料

采集绵阳猪场疑似PRRS发病猪的血，分离血清-20 ℃保存备用。

1.2主要试剂

Trizol LS Reagent，M-MuLV反转录酶，AxyPrepTM PlasmidMiniprep Kit、Agarose Gel DNA Purification Kit，rTaq DNA 聚合酶、DNA Marker DL 2000等购自TaKaRa 公司。

1.3引物设计与合成

根据GenBank 中收录的HP-PRRSV JXA1的基因序列（GenBank 登录号：EF112445.1），利用Primer 5.0 软件设计合成能扩增出区分经典株和HP-PRRSV株 Nsp2基因的引物P1、P2（P1：5′-CAAAGAYCAGATGGAGGAG-3′，P2：5′-ATRATGGCTTGAGCTGAG-3′）以及扩增ORF5全基因的引物P3、P4（P3：5′-GTTTACCCAACGCTCCTTA-3′，P4：5′-ACTGGCGTGTAGGTAATGG-3′）。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，纯度级别为PAGE。基因预计扩增长度分别为 768 bp（经典株）或678 bp（变异株）和801 bp。

1.4病毒总RNA 的提取

按RNA Trizol试剂说明书提取总RNA，具体方法如下：取500 μL血清，加入1 mL Trizol试剂，匀浆，室温静置2～3 min；加入200 μL的三氯甲烷，剧烈振荡，室温静置2～3 min；4 ℃ 12 000 r/min离心15 min；取上清，加入等体积的异丙醇，室温静置10 min，4 ℃ 12 000 r/min离心10 min；弃上清，加入1.0 mL 75%乙醇，振摇，4 ℃ 12 000 r/min离心 5 min；弃去上清，干燥沉淀物（室温约5 min）；用适量无RNase 水溶解沉淀，-20 ℃保存备用。

ORF136基因 篇3

鸡痘病毒ORF073基因克隆及原核表达

根据已经发表的鸡痘病毒(FPV)美国致病株的ORF073基因序列,设计1对引物,分别以282E4FPV、LP株FPV、102E6FPV为模板,扩增出目的片段,将其克隆到pGEM-TEasy载体中,经酶切鉴定证实,并进行序列测定.目的片段包含了大小为522 bp的ORF073基因,与GenBank上的AF198100(FPVUS)和AJ581527(FP9)序列进行序列比较分析表明:3种病毒株的`ORF073基因与鸡痘病毒美国致病株(FPVUS)和英国弱毒株(FP9)完全一致.克隆的ORF073基因与原核表达载体pET-28a构建重组表达载体,经IPTG诱导,在BL21(DE3)细菌中表达了分子质量约32 ku的蛋白.

作 者：王彦红 马怀良 胡顺林 仇旭升 刘秀梵 WANG Yan-hong MA Huai-liang HU Shun-ling QIU Xu-shen LIU Xiu-fan 作者单位：扬州大学,农业部畜禽传染病学重点开放实验室,江苏,扬州,225009刊 名：扬州大学学报(农业与生命科学版) ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF YANGZHOU UNIVERSITY(AGRICULTURAL AND LIFE SCIENCE EDITION)年，卷(期)：200627(4)分类号：Q786 S852.65+9.1关键词：鸡痘病毒 ORF073 基因克隆 原核表达