ABC转运蛋白 篇1
1 材料与方法
1.1 标本来源
实验标本均来自宁夏医科大学附属医院病理科2009年病史资料完备的结直肠肿瘤标本及临床手术切除的肿瘤标本。
1.2 主要试剂与仪器
CD133-PE(MACS);IgG1-PE(BD);RNeasy plus Mini Kit(QIAGEN);TIANScript c DNA第一链合成试剂盒(TIANGEN);Trans Start Green qPCR Super Mix(TIANGEN);所用引物由上海捷瑞生物工程公司合成;鼠抗人MRP1单克隆抗体(Santa)、兔抗人CD133单克隆抗体(中杉金桥);山羊抗鼠FITC、山羊抗兔TRITC、DAPI(中杉金桥);流式细胞仪(FACS,Caliber,美国BD);实时荧光定量PCR仪(ABI,Prism 7300,美国ABI);激光共聚焦显微镜(LSCM,FV1000 IX81,日本Olympus);核酸蛋白测定仪(ND-1000,美国Nano Drop)。
1.3 新鲜肿瘤组织中CD133+细胞的检测
取10例患者术后的肿瘤组织1~2 g,PBS冲洗3、4次,用无菌剪刀将组织剪成1~2 mm3的小块加入胶原酶37℃条件下消化1 h,消化完全后用300目筛网过滤2次获得单个细胞悬液,离心弃上清后重悬细胞并加入PBS,进行细胞计数,调整细胞密度为105个/500μL分别加入CD133-PE和同型对照IgG1-PE,室温放置15 min后PBS洗涤1次,用1m LPBS重悬并用流式细胞仪检测。
1.4 实时荧光定量PCR检测
8例患者于术中切取新鲜结肠肿瘤组织及距肿块3~4 cm处的正常组织块各1.0 cm×1.0 cm大小并放入液氮冻存。分别取肿瘤组织和正常组织30mg用RNeasy plus Mini Kit(QIAGEN)试剂盒提取RNA,核酸蛋白测定仪确定提取的RNA浓度和纯度。用TIANScript c DNA第1链合成试剂盒(TIANGEN)将RNA反转录成c DNA保存于-20℃备用。运用荧光定量PCR方法检测9种常见ABC转运蛋白基因在肿瘤以及正常组织中的表达,以管家基因GAPDH作为对照。表1为所用引物序列。反应体系为20μL、0.5μL c DNA,10μL Trans Start Green qPCR Super Mix(TIANGEN),Forward Primer(10μmol/L)0.5μL,Reverse Primer(10μmol/L)0.5μL,0.3 u Lreference dye,加RNase Free dH2O至总体积20μL。反应条件:50℃2 min,95℃10 min,95℃15 s,55℃30 s,72℃30 s,共45个循环。
1.5 免疫荧光检测
收集宁夏医科大学2009年1月~2009年12月经手术切除并经病理组织学确诊为结直肠肿瘤标本30例,所有标本临床资料完整。标本均经10%福尔马林固定,常规石蜡包埋,4μm厚切片。将切片放入二甲苯脱蜡后梯度酒精水化,微波抗原修复20min,TritonX-100通透细胞5 min后用牛血清进行封闭,室温放置30 min,弃去血清,分别加一抗兔抗人CD133和鼠抗人MRP1,以PBS代替一抗为阴性对照。将加好一抗的组织切片放入湿盒4℃过夜。用PBS将未结合的抗体漂洗干净后加二抗TRITC(山羊抗兔)和FITC(山羊抗鼠),放入37℃湿盒孵育30min后PBS漂洗,最后用DAPI复染3~5 min后封片。荧光共聚焦显微镜观察判断CD133及MRP1的表达。随机选取4个高倍视野约200个细胞,计数肿瘤细胞阳性数,结合荧光强度,阳性细胞数>2%的样本为阳性样本,≤2%为阴性样本。
1.6 统计学分析
采用SPSS 13.0进行统计学分析,计量资料采用均数±标准差表示,9种ABC转运蛋白在结直肠肿瘤组织和正常组织的表达差异采用方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 CD133+细胞检测
运用流式细胞仪检测10份肿瘤组织中CD133+细胞所占的比例,结果显示肿瘤组织中有CD133+细胞存在,平均比例约(2.59±1.26)%。
2.2 9种ABC transporter荧光定量PCR结果
运用实时荧光定量PCR方法检测9种ABC转运蛋白在肿瘤组织和正常组织中的表达水平(见图2)。
A:MRP1、MRP2、ABCG2和MDR1的表达;B:ABCA1、ABCC3、ABCC5、ABCC6、ABCF1和GAPDH的表达
用△CT、2-△△CT相对定量方法分别表示不同组织中的ABC转运蛋白m RNA相对于管家基因GAPDH的表达水平(见图3)及肿瘤组织相对于正常组织ABC转运蛋白m RNA表达水平的倍数。公式如下:
△△CT=(△CT)肿瘤组-(△CT)正常组(平均值)
△CT绝对值越低代表该基因表达水平越高。
MRP1在肿瘤组织中的△CT值(9.05±0.45)低于正常组织中的△CT值(10.09±0.64),且差异具有统计学意义(P<0.05)。由于管家基因GAPDH作为内参在细胞中恒定表达,△CT值越大说明目的基因表达水平越低,反之亦然。因此,在肿瘤组织中MRP1表达水平显著高于正常组织。MRP1组2-△△CT均值为2.06,表示肿瘤组织MRP1的表达水平是正常组织的2.06倍。这一结果说明,该实验中结直肠肿瘤组织中主要高表达的ABC转运蛋白种类为MRP1。
2.3 MRP1在结直肠肿瘤CD133+细胞中的表达
依据RT-PCR结果,为进一步研究MRP1的表达与结直肠肿瘤干细胞的关系,该研究用免疫荧光检测与共聚焦显微分析方法检测了MRP1在结直肠肿瘤CD133+和CD133-细胞中的表达,结果见表2。由于CD133+细胞比例在多数结直肠肿瘤样本中大于2%(图1),故选定2%为判定结直肠肿瘤样本为CD133+或CD133-的界限。在检测的16例结直肠肿瘤样本中有3例为CD133和MRP1双阴性,27例患者为CD133与MRP1共表达。图4为共聚焦显微镜下CD133+和MRP1单独观察及共聚焦观察的结果。这一结果证明,在结直肠肿瘤组织中,大部分MRP1阳性细胞为CD133阳性细胞。
DAPI对细胞核染色如图4A,CD133+细胞被TRITC结合发红色荧光如图4B,MRP1+细胞与FITC结合发绿色荧光如图4C,将4B图和4C图重叠后可以看到在同一个细胞上既有CD133表达同时也有MRP1的表达。
3 讨论
近年干细胞研究表明,肿瘤细胞中存在着一小部分具有干细胞特性的细胞亚群,这些细胞具有自我更新、无限增殖和分化的潜能,是肿瘤增殖、复发、转移以及肿瘤抗药性的细胞学根源。
人CD133分子是120 kD的糖蛋白[9]。2006年O’BRIEN等研究人员用500个CD133+细胞注射入NOD/SCID小鼠体内并形成肿瘤[10]。RICCI-VITIANI等的研究认为占结直肠肿瘤细胞总数约2.5%的CD133+结直肠肿瘤细胞是结直肠肿瘤的起始细胞[11]。近年来随着研究的深入,越来越多的证据表明,CD133可能是肿瘤干细胞表面特异性分子,并且极有可能成为治疗肿瘤的一个有效的靶点。笔者的实验通过FACS分析印证了RICCI-VITIANI等人的研究结果,结直肠肿瘤组织中存在着(2.59±1.26)%的CD133+细胞。
目前放化疗是肿瘤治疗的主要手段,通过治疗后大部分的肿瘤细胞被杀死从而使瘤体减小,但是仍有部分肿瘤细胞残留下来成为日后肿瘤复发和远处转移的罪魁祸首,最终导致了化疗的失败。逃过放化疗的肿瘤细胞被认为具有外排药物的功能而存活下来[12]。ABC转运蛋白是膜转运蛋白家族中的一类特殊蛋白,有着高度同源的结构和序列。迄今为止,共发现了48个人类ABC基因,这些跨膜转运蛋白利用ATP水解释放能量从而实现底物分子在胞膜内外的逆浓度梯度转运[13]。ABC转运蛋白对肿瘤细胞抗药性起着重要的作用。笔者对9种ABC transporter进行实时荧光定量PCR的检测,发现MRP1在肿瘤组织中的表达高于正常组织。MRP1是从耐阿霉素小细胞肺癌细胞系中发现的一种ABC转运蛋白,在耐药细胞中其基因表达水平高于敏感细胞近100倍[14]。MRP1在急性髓细胞性白血病、小细胞肺肿瘤以及神经母细胞瘤中过表达,但在结直肠肿瘤中的表达鲜见报道。在笔者研究中,MRP1在直肠肿瘤中表达显著高于正常组织,说明MRP1可能在直肠肿瘤细胞抗药性中起主要作用。同时对结果的分析发现,9种蛋白在第4例患者肿瘤组织中均低表达而在第3例患者肿瘤组织中的表达均高于癌旁组织,怀疑与患者是否用药有关。
从免疫荧光结果来看,作为药物外排泵的MRP1转运蛋白主要表达在肿瘤干细胞表面标记的CD133阳性的细胞群,说明CD133阳性的肿瘤干细胞可能对肿瘤抗药起主要作用。这个实验结果也与DEAN提出的一种肿瘤耐药模式相符合,即干细胞天生耐药。有文章报道MDR和ABCG2两种ABC转运蛋白参与结直肠肿瘤多药耐药,但笔者实验发现MRP1即ABCC1在结直肠肿瘤干细胞中同样表达参与肿瘤耐药。
ABC转运蛋白 篇2
文章编号：1004-7484（2013）-12-7784-01
近年來许多研究表明肝癌的耐药可能与ATP结合（ABC）转运蛋白机制有关。因而了解ABC转运蛋白表达的调节和功能是非常必要的。
1 ABC转运蛋白
ABC转运蛋白属于ATP结合盒（ATP-binding cassette，ABC）转运超家族成员。ATP结合转运蛋白是膜运输蛋白最大的之一，这些蛋白质利用一对腺苷ATP排出特定的分子化合物或转移他们从膜内到膜外，因此，他们负责不同基质的跨膜屏障，如金属离子、糖、多肽、蛋白质、氨基酸和大量的疏水化合物和代谢产物。人类有49个ABC转运蛋白基因，依据序列同源性和ATP结合的蛋白成分分为七个亚型。
ABC完整转运蛋白包含两个跨膜域（TM）和两个核苷酸结合褶皱（NBFs）域或者作为半转运体包含一个TM与NBFs。然而NBFs为ATP结合和水解产生运动力，NBFs为复合物的转运建立途径。
ABC转运蛋白的主要作用是保护细胞不积累有毒化合物，因而这些蛋白质有能力排出药物和减少细胞对药物的敏感性，这说明了ABC转运蛋白和耐药间有密切关系。许多研究表明[1]，耐药分子基本与ABC转运体有关。一些ABC转运蛋白如多重耐药1（ABCB1/MDR1/PGY1），多药耐药相关蛋白-1（ABCC1/MRP1），耐药相关性蛋白-3（ABCC3/MRP3）与乳腺癌耐药蛋白（ABCG2/BCRP/MXR）被发现。ABCB1表达[2]主要在肝脏和血脑屏障，参与细胞保护。这些蛋白质具有广泛的底物特异性和调控多种抗癌药物，如阿霉素、秋水仙素、长春碱等。在肝癌中，ABCB1的表达不相同，可高或可低，甚至没有表达。研究显示[3]，ABCB1的过分表达与肝癌侵袭性和生存期减少有关，ABCB1可作为肝癌外科切除术后病人预后标记。另一项研究表明[4]，肝癌ABCB1的表达比非肿瘤性组织更低，也没有与侵袭性肿瘤表型及生存有关。因此ABCB1的表达与组织学细胞分化密切相关，这可能是肝癌个体中不同表型的分散表达，另一种解释可能是ABCB1的多态性的存在。
ABCC1的作用主要是运输共轭胱甘肽，葡糖醛酸盐和硫酸盐共轭化合物及抗癌药物，对保护细胞氧化应激有重要性。王桂兰等[5]研究报道，在原发性肝癌中有ABCC1的表达，但是呈现低表达，与肝癌的预后有密切关系。
人类乳癌细胞中的ABCG2被首次确认。在许多正常的组织如胎盘、脑、前列腺、小肠、睾丸和肝脏中这种蛋白质有表达。ABCG2耐受的肿瘤药物包括米托蒽醌，喜树碱衍生物，咔唑拓扑异构酶I抑制剂，氨蝶呤和黄酮吡醇。盐酸伊立替康（CPT-11）是一种有效的抗癌药物，ABCG2是影响CPT-11敏感性的因素之一[6]，在各种实性肿瘤中有40%不同程度的表达ABCG2呈阳性[7]。
2 ABCG2与干细胞中的侧群细胞
侧群细胞（SP）的富集是从一种净化的造血干细胞中得来的，通过流式细胞仪观察鼠科骨髓细胞外排Hoechst33342的活动。侧群细胞被视为“迟钝细胞”，由于SP细胞的独特功能-排出细胞内的染料，在点图上呈现低或阴性的荧光。SP细胞的活动就是排出多种底物，包括染料和药物，被认为与耐药有密切的联系。
在肝癌细胞系中观察到ABCG2的高表达与SP细胞表型有密切联系，这表明[8]BCRP1可作为SP细胞的分子表型标记。从肝癌细胞系HCCLM3，MHCC97-H，MHCC97-L和Hep3B中分离得到的SP细胞，可能与转移潜能和耐化疗有关。进一步研究这些细胞株ABCG2表达的情况，发现ABCG2+细胞生成ABCG2+和ABCG2-细胞，而ABCG2-细胞只生成ABCG2-细胞。在肝癌中，SP细胞也有相关报道。使用二乙基亚硝胺诱导转化的肝癌肝组织鼠模型观察发现[9]，SP细胞表型通过ABCG2/BCRP1表达来确定。陈伟等[10]研究表明，肝癌细胞系中ABCG2的表达极大地影响药物外流的水平。SP细胞涉及化疗耐药相关的药物外流，SP分析被认为是一种有效的评估ABCG2功能活动的方法。然而，ABCG2也表达在其他的正常组织，ABCG2也许不是最好的唯一标记识别干细胞。通过SP技术从各种组织获得的干细胞分子表型的标记是不同的。此外，SP干细胞的表征和定义有一些限制。Hoechst染料对细胞有毒性，外排是一个生物过程，可能会影响结果。
3 ABC转运蛋白抑制剂
肿瘤干细胞最重要的一个表现是抵抗标准的化疗。化疗药物和特定的ABC转运蛋白靶向抑制剂联合使用可能是一种很好的杀死癌细胞的策略。这种方法重点是通过增加细胞对药物的敏感性和抑制药物外流，彻底根除肿瘤，阻止癌症复发。目前增加癌症细胞对抗癌药物敏感性的实验与临床研究正在进行。在肝癌中几种化合物被使用去阻碍ABCB1，ABCC1和ABCG2，例如溴隐亭和肿瘤坏死因子-α的协同效应逆转裸鼠ABCB1模型的肝脏肿瘤。另外，使用脂质体包裹的药物经肝动脉给药治疗和ABC转运蛋白核酸病毒体的构建被认为是一个高效和安全系统。
4 展 望
目前的研究对ABC转运蛋白与肝癌耐药的机制不是很清楚，我们应进一步研究ABC转运蛋白耐药的调节通路，生产出更有效的ABC转运蛋白调节剂和抑制剂，为解决临床肝癌耐药提供一种新思路。
参考文献
[1] 黄九九，洪梅.肿瘤多药耐药性中的ABC转运蛋白及其调节[J].现代生物医学进展，2009，9（23）；4571-4573.
[2] 李海平，高波，余宗涛，等.MRD1基因的表达与肝癌生物学行为指标的关系[J].现代肿瘤医学，2013，21（01）：129-132.
[3] 权毅，严律南.多药耐药基因mdr1在肝细胞性肝癌中的表达及其意义[J].中国普外基础与临床杂志，2003，10（4）：370-375.
[4] 陈徐艰，王晓光，沈亦珏，等.MDR1基因单核苷酸多态性与肝细胞肝癌预后的关系[J].肿瘤学杂志，2011，17（3）：209-211.
[5] 王桂兰，陈莉，鄂群，等.原发性肝细胞肝癌中MRP-1表达的意义[J].天津药医药，2008，36（3）：163-166.
[6] 王晰程，孙志伟，沈琳，等.ABCG2与消化系统肿瘤相关研究进展[J].胃肠病学和肝病学杂志，2013，23（7）：699-672.
[7] 王文静，韦曦.侧群细胞的研究进展[J].国际口腔医学杂志，2011，38（6）：665-668.
[8] 陈雪松，张朵，张红霞，等.高表达ABCG2基因对人原发性肝癌细胞SP表型的影响[J].中国生物制品学杂志，2012，25（8）：973-976.
[9] 张朵，朱海英，谢东甫，等.二乙基亚硝胺诱导转化的肝癌肝组织小鼠中SP细胞的观察[J].医学研究生学报，2006，19（5）：424-427.
植物蔗糖转运蛋白 篇3
植物蔗糖转运蛋白
文章概述了植物蔗糖转运蛋白的结构、性质和类群的研究进展.
作 者：白雪梅 张立军 吴晓丹 胡凯 阮燕晔 BAI Xue-Mei ZHANG Li-Jun WU Xiao-Dan HU Kai RUAN Yan-Ye 作者单位：沈阳农业大学生物科学技术学院,沈阳,110161 刊 名：植物生理学通讯 ISTIC PKU英文刊名：PLANT PHYSIOLOGY COMMUNICATIONS 年，卷(期)：2006 42(6) 分类号：Q94 关键词：植物 蔗糖转运蛋白