基因电子克隆 篇1
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)可清除生物氧化过程中产生的超氧阴离子自由基,被称为生物体抗氧化系统的第一道防线[3]。1969年从牛红血细胞中发现并正式命名以来,人们已从催化机理、分子结构[4],到化妆品、食品、药品等方面的应用[5],都进行了广泛而深入的探索。根据所含金属辅基的不同,可分为Cu/ZnSOD、FeSOD、MnSOD、Fe/MnSOD和NiSOD五种。MnSOD主要存在于原核生物胞浆及真核生物的线粒体中。免疫组化分析表明,MnSOD前体可在前导肽作用下运输到线粒体内发挥功能[6]。目前已在斑马鱼[7]、牙鲆[8]、暗纹东方鲀[9]等鱼类中克隆了MnSOD基因,但尚未见到泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)MnSOD基因的报道。本研究以泥鳅EST数据库为基础,采用电子克隆技术获得泥鳅MnSOD基因,并对该基因及其编码序列进行了序列及功能分析,以期为泥鳅进一步的分子生物学及抗氧化研究提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 生物信息学数据库和软件
本研究采用的核酸及蛋白质序列数据来自数据库GenBank,相关的在线分析工具见表1。
1.2 方法
1.2.1 泥鳅MnSOD基因的电子克隆策略
以斑马鱼(Danio rerio)MnSOD氨基酸序列(NCBI登录号:NP_956270)作为查询序列,用tblastn程序检索GenBank中的泥鳅EST数据库。将检索到的相似性最高且含有MnSOD保守结构的EST序列(登录号BJ820585)作为种子序列,用blastn继续检索泥鳅EST数据库,将检索到的泥鳅EST序列采用CAP3程序组装和延伸,重复检索、延伸步骤直到不能延伸为止,最后得到泥鳅MnSOD基因的cDNA序列。
1.2.2 泥鳅MnSOD基因的生物信息学分析
采用NCBI的ORF finder在线程序对获得的cDNA序列进行ORF预测,并用DNAStar、BioEdit等软件推导相应的氨基酸序列、分析其编码蛋白的等电点及分子量。
1.2.3 泥鳅MnSOD的氨基酸序列分析
用blastp程序将泥鳅MnSOD与数据库中的蛋白质序列进行比对,相似性高的不同物种MnSOD氨基酸序列再用ClustalX1.83软件进行联配后,经Mega4.0软件建立分子进化树。用丹麦科技大学的TargetP在线程序分析其亚细胞定位。ExPASy服务器上的ProtScale和prosite程序分别用于分析其疏水性及保守结构域。以法国的SOPMA在线程序预测泥鳅MnSOD的二级结构;并用同源模建法采用序列一致性最高的人类MnSOD(PDB:1MSD_A)作为模型,用Geno3D程序预测三级结构。
2 结果与分析
2.1 泥鳅MnSOD基因cDNA序列的电子克隆及基本信息分析
以斑马鱼MnSOD氨基酸序列(NCBI登录号:NP_956270)对泥鳅dbEST进行tblastn检索,可得相似性最高的EST序列BJ820585。以之为种子序列检索泥鳅dbEST,得4条EST序列(BJ820585,BJ831607,BJ835051,BJ823823)。用CAP3程序将这4条序列进行拼接组装,最后拼接延伸得到879bp的contig。以之为种子序列,再次检索泥鳅dbEST,结果无新的EST序列。表明所得的contig已不能再延伸。
采用NCBI的ORF finder并结合DNAStar、BioEdit软件对所得的contig进行分析,发现该cDNA序列推导编码的最大开放阅读框为675bp。共编码224个氨基酸(图1),所编码的蛋白质分子量约为25kDa,等电点约为8.41。
分析该ORF,发现起始密码子上游(-3)位为A,下游(+4)位为C,较符合真核生物翻译起始位点的Kozak序列(A/GNNATGG)[15]。通过在线工具Hcploya预测其转录终止信号,发现在ORF下游3’端(+821)含有典型的poly(A)加尾信号(AATAA)。表明克隆到的为泥鳅MnSOD基因完整的cDNA序列。
2.2 泥鳅MnSOD氨基酸序列的比对及分子进化分析
将泥鳅MnSOD氨基酸序列与数据库中的其他蛋白质序列进行blastp比对。结果表明泥鳅MnSOD与斑马鱼(Danio rerio,NP_956270)、朝鲜鱼骨(Hemibarbus mylodon,ACR23311)、鳙鱼(Hypophthalmichthys nobilis,ADM26563)、胡瓜鱼(Osmerus mordax,ACO10131)、斜带石斑鱼(Epinephelus coioides,AAW29024)、大西洋鲑(Salmo salar,ACN10263)、白斑狗鱼(Esox lucius,ACO13457)、裸盖鱼(Anoplopoma fimbria,ACQ59022)、军曹鱼(Rachycentron Canadum,ABC71306)、暗纹东方鲀(Takifugu obscurus,ABV24053)、牙鲆(Paralichthys olivaceus,BAJ79013)、欧洲鳗鲡(Anguilla anguilla,ABF50548)等MnSOD的一致性(identities)很高,在86%到95%之间。说明这些物种之间的MnSOD在初级结构上相当保守。
用ClustalX软件对这些序列进行多重比对,结果显示泥鳅MnSOD与其他物种来源的MnSOD在一级结构上非常保守,多个氨基酸位点上高度一致,只在N端前20多个序列差异较大(图2)。结合数据库中各个物种MnSOD的注释和多序列比对结果,可推测泥鳅MnSOD的第27至第108之间的氨基酸片段(27-108)为其N端保守区域,而第113至第218之间的氨基酸片段(113-218)则为C端保守区域。它与Mn+的结合位点分别是His52、His100、Asp185和His189,与其他物种来源的MnSOD在这些位点上完全一致。表明这些位点在MnSOD中非常重要,在进化过程中都异常保守。
利用Mega4.0软件,采取NJ(Neighbour-joining method)法和Poisson Correction模型对泥鳅MnSOD建立分子进化树(图3),bootstrap自检选择500。结果表明:泥鳅MnSOD与淡水鱼中鲤形目其他物种的MnSOD在进化上亲缘关系最相近,同属于一个进化分支。与海水鱼相比,泥鳅MnSOD与鲑形目来源的MnSOD亲缘关系相近,而与其他目的海水鱼亲缘关系较远。
2.3 泥鳅MnSOD氨基酸序列的生物信息学分析
采用TargetP程序对获得的泥鳅MnSOD蛋白质序列进行亚细胞定位预测。结果表明本研究所得的氨基酸序列定位于线粒体中(图4)。这与blastp比较的结果相符。
进一步采用ProtScale程序的“Kyte and Doolittle”算法分析其疏水性(图5)。正值越大疏水性越高,负值越大亲水性越高,介于+0.5和-0.5之间的主要为两性氨基酸。结果显示泥鳅MnSOD的N端前26个氨基酸疏水性强,疏水性氨基酸和碱性氨基酸[主要是赖氨酸(K)和精氨酸(R),无组氨酸(H)]占绝大多数,有少量的羟基氨基酸[丝氨酸(S)和苏氨酸(T)],缺乏酸性氨基酸。这符合线粒体MnSOD转运肽(transit peptide)的特征[6]。而blastp显示的结果也多为线粒体来源的MnSOD,因此可推测其N端为线粒体转运肽。除N端外其他的氨基酸序列中亲水片段非常多,表明其应为亲水性蛋白。
下划线:起始密码子;方框:终止密码子;灰色底纹:poly(A)加尾信号。
Under line: Start codon;box: stop codon;gray shading: poly(A) tailing signal.
箭头1:Mn+的结合位点;三角形:修饰位点;实线框:MnSOD的信号区。
Arrow: Mn+ binding site;Triangle:modified site;Box: MnSOD signature.
利用Prosite在线程序分析其保守结构域,结果表明在185～192之间的氨基酸片段是MnSOD的信号区域(图2)。而多序列比对的结果表明这个区域极其侧翼序列异常保守。
2.4 泥鳅MnSOD的二级结构及三级结构预测
利用PBIL LYON-GERLAND信息库采用HNN法(Hierarchical neural network)对泥鳅MnSOD的二级结构进行预测,结果表明泥鳅MnSOD的二级结构中最多的是不规则卷曲(Random coil,Cc)(42.41%),有95个氨基酸可形成这样的二级结构。另有70个氨基酸可形成α螺旋结构(alpha helix,Hh)(31.25%),59个氨基酸能形成延伸(Extended strand,Ee)(26.34%)(图6)。
通过Blastp程序对PDB数据库进行比较,选择序列一致性(Sequence Identity)最高(85%)的人类MnSOD(PDB:1MSD_A)作为模型,利用Geno3D在线程序采用同源模建法预测泥鳅MnSOD的三级结构,并用Swiss-PdbViewer软件查看所得的三维结构(图7)。结果显示泥鳅MnSOD是由11个大小不同的α螺旋、6个的β折叠(strands)、16个β转角(turns)以及一些无规卷曲构成的不规则椭球体。其N端为两个长的反平行螺旋,C端则为含有拧成三股折叠片的α+β结构,与人的MnSOD(PDB:1MSD_A)的三维结构高度相似。
3 讨论
生物信息学技术是分子生物学与计算机科学的有机结合体,是21世纪生命科学的核心领域之一。随着多个物种基因组测序计划的完成,利用生物信息学技术对基因编码蛋白进行理化性质、结构、功能的预测的确信度也越来越高。电子克隆是近年快速发展起来的一项投入低、速度快、针对性强的基因克隆的新技术。已有多个研究者在人类、猪、玉米、小麦等多个物种中利用这项技术克隆到功能基因[16,17,18,19]。
泥鳅在分类上隶属于硬骨鱼纲、鲤形目、鳅科、花鳅亚科、泥鳅属,是一种重要的小型淡水经济鱼类,杂食性(偏动物食性),底栖,具有较高的营养和药用价值。我国每年都大量出口泥鳅,尤其是日本、韩国需求量较大。目前对其研究多集中在不同方式的养殖技术[20]、生物学特性[21]、病原诊断[22]、营养价值[23]、活性物质的研究[24,25,26]等方面,在分子生物学及生物信息学层面上开展不多。张际峰等[27]克隆了泥鳅的18S rRNA基因并建立其系统发育树。彭扣等[38]克隆了泥鳅的肌肉生长抑制素基因的主要片段,RT-PCR实验表明泥鳅的肌肉生长抑制素基因除了对肌肉生长发育有调控作用外,还可能在眼的生长发育中起一定作用。杜启艳等[29]克隆了泥鳅的生长激素基因并在大肠杆菌中获得了表达;同时他们还克隆了芳香化酶基因,并分析其不同时空的表达情况[30]。而在UniProt蛋白质数据库中登记的来自泥鳅的全长蛋白质序列(截止时间2010年12月4日),也仅有细胞色素c氧化酶类、生长激素、主要嗅觉受体类、ATP合成酶、细胞色素b、孵化酶、抗菌肽、NADH乌比醌类氧化还原酶、转录因子、vasa蛋白、NADH脱氢酶、肌动蛋白等。
本研究应用生物信息学方法,利用比较基因组中不同物种中基因的同源性理论,跨过物种的界限,根据斑马鱼的MnSOD序列对泥鳅MnSOD基因进行了快速克隆,获得了泥鳅MnSOD基因的cDNA。由于此基因是通过生物信息学的方式得来的,因而可能与泥鳅真实的MnSOD基因有所差别,需要通过分子生物学实验的方法对序列进一步验证。本研究下一步将提取泥鳅的RNA,再根据所得的序列设计PCR引物,通过RT-PCR方法验证所获得的序列。
蓝色:α螺旋;红色:片层结构;紫色:不规则卷曲。
Blue: α helix;red: extended strand;purple: random coil.
4 结论
基因电子克隆 篇2
关键词：克隆选择,基因重组,高频变异,函数优化
0 引言
生物免疫系统是生物体内结构最为复杂、功能最为独特的系统之一。研究生物免疫学机理, 成为当代生命科学中的前沿学科[1]。人工免疫系统AIS (Artificial Immune System) 是模仿生物免疫系统功能的一种新的智能方法, 是继模糊逻辑、进化计算和神经网络后, 人工智能领域又一研究热点[2,3,4]。Castro等根据免疫克隆选择机理, 提出了一种克隆选择算法[5], 并成功用于模式识别和函数优化[6]。随着人工免疫系统的迅速发展, 一些基于克隆选择机理的新算法相继提出, 李恒杰等提出了一种基于单一高斯算子变异的克隆选择算法[7], 加快解的收敛性, 同时保持解的多样性和分布的均匀性。胡江强等人提出了一种分级变异的动态克隆选择算法[8], 根据抗体亲和度将种群分解为3个子种群, 实施不同的变异策略, 加快全局搜索速度, 提高局部搜索精度。焦李成、杨咚咚、公茂果等人提出了一种基于偏好等级的免疫记忆克隆选择优化算法[9], 利用决策者提供的偏好信息来为抗体分配偏好等级, 增大抗体选择压力, 加快收敛速度。陶新明等人提出了一种混合变异克隆选择算法 (HMC-SA) [10], 在抗体进化过程中, 不同抗体种群采用不同的变异算子, 并通过外部记忆抗体群的更新, 保留进化的最优抗体, 避免算法进化后期出现的退化现象。
克隆选择算法CSA (Clonal Selection Algorithm) 是模拟生物免疫系统抵御外来抗原侵袭的一种自主学习进化过程。与遗传算法的有性繁殖 (父代基因交叉变异) 不同, 免疫克隆选择算法是通过无性繁殖 (自身克隆变异) 连续传代生成抗体种群, 并利用高频变异提高抗体克隆种群的亲和力, 从而实现抗体种群的不断进化, 最终找到最优抗体[11]。与传统克隆选择算法相比, 虽然改进的克隆选择算法克服了局部搜索能力低和进化缓慢的不足, 但是高频变异的随机性和不确定性可能会导致出现退化现象, 影响算法的收敛速度和降低全局搜索的能力。本文根据克隆选择机理, 利用生物工程中的基因重组技术, 提出一种基于基因重组的克隆选择算法 (GRCSA) 。根据抗体与抗原之间亲和力的大小, 获取优秀抗体的优秀基因片段, 并对亲和力低的抗体进行基因的交换与重新组合, 实现定向变异的目的, 防止种群退化, 提高变异效率。另外, 根据不同抗体浓度进行不同规模的克隆增殖, 保持抗体种群的多样性, 扩大全局的搜索范围, 防止陷入局部收敛。最后利用测试函数对算法性能进行评估, 并与文献[10]的算法进行比较, 实验结果验证了本文提出的算法提高了其收敛速度和解的精度, 证明算法的有效性。
1 基因重组的形式化描述
在生物工程领域, 基因是包含遗传信息的DNA分子片段, 基因重组技术就是对生物体的DNA分子进行交换和重新组合, 形成新的DNA分子, 改变生物体某些外在性状[12]。基因重组的优点是在生物体的DNA分子发生变异的过程中, 有方向性地改变生物体的基因组成, 避免生物体基因 (DNA分子) 出现有害变异, 导致退化现象。在克隆选择算法中, 基因重组包含两个过程:第一, 提取优秀抗体的优秀基因片段;第二, 利用优秀基因片段, 通过某些技术手段, 对抗体的某些DNA分子片段进行交换和重新组合, 形成新的抗体DNA分子, 从而达到改变抗体基因的目的。将基因重组做如下形式化描述:
定义1将基因重组形式化描述成一个三元组GR=
1.1 抗体优秀基因片段
在生物免疫学中, 虽然抗体表面有多个表位, 但在诱导免疫应答时只可能是一种或者一个表位其主要作用, 使宿主产生特异性为主的免疫应答, 这种现象叫作免疫显性或免疫优势, 关键作用的表位叫作显性免疫优势点[13,14]。在抗体DNA分子中, 显性免疫优势点是由某段基因片段表达的, 称为优秀基因片段。基因重组的基础就是获取优秀基因片段。
在人工免疫系统中, 抗原、抗体以及抗原/抗体的亲和力分别对应函数优化问题的目标函数、优化解以及解与目标函数的匹配程度。人工免疫系统借鉴生物免疫学的有关机理, 通过抗体自身的不断进化以适应抗原的刺激, 达到解决目标函数最优值的目的。为了简化问题, 将被优化的目标函数记为f:F→F', 亲和力函数aff一般为目标函数f。对于抗体编码, 每个抗体Ab∈Bl、Bl={0, 1}l代表由长度为l的二进制串组成, 这个二进制串表示抗体的DNA分子, 抗体种群Ab={Ab1, Ab2, …, Abn}为抗体Ab的n元组。
定义2假设每一个抗体是由一个长度为l的二进制串组成, 记为Ab=[ab1, abn, …, abn], 如果它满足:f (Ab) =f (ab1, …, abi-1, 1, abi+1, …, abl) ≥f (ab1, …, abi-1, 0, abi+1, …, abl) 或者f (Ab) =f (ab1, …, abi-1, 1, abi+1, …, abl) ≤f (ab1, …, abi-1, 0, abi+1, …, abl) , 则称抗体的第i位为优秀基因片段, 其性状表达为显性免疫优势点。
1.2 抗体优秀基因片段的获得
利用获取的优秀基因片段, 改造与抗原亲和力低的抗体的基因, 使之表现出显性免疫优势点的外在性状, 促使每次变异都趋向于好的方向, 从而达到定向变异的目的, 提高变异效率和算法收敛速度。
优秀基因片段的获得算子:
1) 定义规模为n的初始抗体种群Ab={Ab1, Ab2, …, Abn}, 每个抗体的DNA分子由l位二进制串表示。抗体种群可记为:
2) 计算种群中每个抗体的亲和力, 根据亲和力大小, 选取亲和力大的优秀抗体。定义一个参照抗体Abs, 用来记录显性免疫优势点, 从而提取优秀基因片段。
3) 利用参照抗体Abs, 对亲和力低的抗体的DNA分子进行交换与重新组合, 改变其DNA分子, 使其获得优秀基因片段, 表现出显性免疫优势点的外在性状, 实现高频变异中的定向变异。
2 基于基因重组的克隆选择算法
本文在传统克隆选择算法的基础上, 借鉴基因重组技术, 提出了一种基于基因重组的克隆选择算法, 对传统克隆选择算法中的高频变异进行定向控制, 使每一次变异都趋向于好的方向, 产生更优秀的抗体, 避免出现退化现象, 提高算法的收敛速度。假设一个规模为n的抗体种群Ab={Ab1, Ab2, …, Abn}, 每一个抗体的DNA分子由l位二进制串组成, 即Abi=[ab1, ab2, …, abl], i∈[1, n]。对基于基因重组的克隆选择算法作如下形式化描述:
克隆选择规则Rscs对初始抗体种群进行亲和力计算, 然后根据亲和力大小, 选择亲和力高的抗体进行克隆增殖。具体规则如下:
Rscs规则具体包括计算抗原和抗体亲和力的值和根据亲和力大小对初始抗体种群进行排序两个过程:
(1) 计算抗原与抗体之间的亲和力的值, 得到一个抗体亲和力的集合Aff={aff1, aff2, …, affn}。如今最常用的计算亲和力的方法有:Euclidean距离 (式 (2) ) 、Manhattan距离 (式 (3) ) 以及Hamming距离 (式 (4) ) :
(2) 根据亲和力大小对亲和力集合的个体进行排序, 得到新的抗体种群序列rank (Aff) ={Ab'1, Ab'2, …, Ab'n}。另外, 定义一个克隆选择概率P, 由如下公式求得:
其中, pi是第i个抗体的选择概率, affi是第i个抗体与抗原的亲和力, i∈[1, n]。根据克隆选择规则Rscs, 选择出ε×n优秀抗体, 即种群{Ab'1, Ab'2, …, Ab'ε×n}进入克隆增殖过程, 对应的选择概率为{p1, p2, …, pε×n}。ε是克隆选择参数, 决定克隆选择的数目。
克隆增殖规则Rpcs对克隆选择出的优秀抗体种群Rscs (Ab) , 根据抗体/抗原亲和力的大小, 进行不同规模的克隆增殖, 具体规则如下:
其中, Ab'i=×jAb'i, (i∈[1, ε×n], j∈[p1, pε×n]) , 是克隆增殖参数, 决定不同的克隆增殖规模。根据克隆选择概率, 对概率大且浓度低的抗体进行优先克隆, 且克隆的规模与选择概率成正比, 即选择概率越大, 克隆规模越大。
克隆变异规则Rhcs运用基因重组技术, 借助从优秀抗体的DNA分子中获取的优秀基因片段, 对亲和力低的抗体的DNA分子进行交换和重新组合, 使之表现出高亲和力的性状, 达到定向变异、提高变异效率的目的。具体规则如下:
其中克隆变异概率与克隆选择概率成反比, 即选择概率越小, 变异概率越大。Rhcs规则具体包括获取优秀抗体的优秀基因片段和定向改造抗体DNA分子两个过程:
(1) 获取优秀抗体的优秀基因片段。根据抗体/抗原亲和力大小, 选取η个优秀抗体。定义一个参照抗体Abs, 用来记录优秀基因片段, 获取方法如下:
(2) 定向改造抗体DNA分子。利用参照抗体Abs, 对亲和力低的抗体进行DNA分子的重组, 将获取的优秀基因片段注入其DNA分子内, 定向改造亲和力的性状, 从而达到定向变异的目的。具体方法如下:
其中, Abm表示亲和力较低的抗体, Ab'm表示经过基因重组改造以后的抗体, remove () 是根据参照抗体Abs对抗体Abm的DNA分子进行交换和重组操作算子。
免疫记忆规则Rmcs从优秀抗体种群中选取一定数量的优秀抗体进入记忆细胞集合, 成为记忆细胞, 用于引发二次免疫应答。具体规则如下:
其中λ是免疫记忆参数, 决定生成记忆细胞的个数。
基于基因重组的克隆选择算法的算法流程如下:
Step1随机生成规模大小为n的初始抗体种群Ab={Ab1, Ab2, …, Abn};
Step2 For每一代种群do
{
Step2.1对随机生成的初始抗体种群Ab, 按照克隆选择规则, 进行Rscs (Ab) 操作, 构成规模大小为k的子种群Abk;/*计算抗体/抗原的亲和力, 按照亲和力大小对抗体种群进行排序, 选取亲和力较大的抗体形成子种群*/
Step2.2对子种群Abk, 参照克隆扩增规则, 进行Rpcs (Abk) 操作;/*对选择出来的抗体根据亲和力大小进行克隆增殖, 亲和力越大增殖的规模越大*/
Step2.3对于余下种群Abn-k, 参考克隆变异规则, 进行Rhcs (Abn-k) 操作, 对低亲和力的抗体进行定向变异, 改变其亲和力;/*获取优秀抗体的优势基因片段, 借助基因重组技术对亲和力低的抗体进行有效的改造, 完成变异过程*/
Step2.4参照免疫记忆规则, 进行Rmcs (Abn-k) , 生成记忆细胞;/*选取最优抗体成为记忆细胞, 用于引发二次免疫应答*/
Step2.5将原种群中亲和力低的 (l+r) 个抗体用l个优秀抗体和r个随机生成抗原细胞进行代替进入下一代新的抗体种群;/*引入部分随机生成的抗体, 避免陷入局部最优解*/
}
Step3直到满足算法结束条件
Step4从抗体种群中选择亲和力最大的抗体作为最优抗体
3 仿真实验与结论
为了评估基于基因重组克隆选择算法的在收敛速度与搜索范围的性能, 实验选取如式 (11) 、式 (12) 作为测试函数, 并与基于混合变异的克隆选择算法进行比较:
基于混合变异的克隆选择算法采用文献[9]的代码, 种群规模为100, 每个变量 (抗体) 的二进制编码 (抗体DNA分子) 长度为20位, 测试函数与亲和力函数的映射关系如式 (13) , 亲和力值越大, 说明抗体越好, 越接近函数的最优值 (测试函数的极小值) 。终止条件是达到给定的最大进化代数 (本文的进化代数是200) 或者是解在连续30次迭代中不再变化, 认为算法基本收敛, 算法结束。
其中, f (Ab) 为抗体Ab对应的可行解的目标函数值, β是调节因子。
利用基于基因重组的克隆选择算法 (GRCSA) 和基于混合变异的克隆选择算法 (HMCSA) 分别对对目标函数f1和目标函数f2进行性能评估, 实验数据如下表所示。
从表中可以看出, 在算法进化过程中, 通过GRCSA算法得到的测试函数的极小值和种群均值都要小于由HMCSA算法得到的。另外, 对于测试函数f2, 由于是函数本身就是多峰函数, 具有多个函数极小值, 通过GRCSA算法得到函数的极小值小于HMCSA算法得到的, 说明GRCSA算法扩大了问题解的搜索范围, 提高了目标函数最优解 (极小值) 的精度。
图1和图2分别是目标函数f1和f2的进化曲线, 横坐标轴为进化代数, 纵坐标轴为测试函数的极小值。从图中可以看出, GRCSA算法的收敛迭代次数要明显低于HMCSA算法的, 并且每次迭代GRCSA算法取到的测试函数的极小值均小于HMCSA算法的, 说明GRCSA算法在种群进化速度上优于HMCSA算法。基于基因重组的克隆选择算法是借助基因重组技术, 在抗体高频变异阶段, 对亲和力低的抗体进行定向变异, 提高了抗体变异效率和算法收敛速度。因此, 在进化初期, GRCSA算法的收敛速度明显快于HMCSA算法的。另外, 基于基因重组的克隆选择算法根据相同亲和力的不同的抗体浓度, 对抗体进行不同规模的克隆增殖, 增加了优秀抗体的种类及多样性, 避免在收敛速度加快的同时, 陷入局部收敛, 造成局部最优的情况。在进化后期, 虽然两种算法都达到了一种基本收敛, 但是从测试函数的极小值上看, GRCSA算法得到函数极小值是小于HMCSA算法的, 从而证明基于基因重组的克隆选择算法在收敛速度和搜索范围的有效性。
4 结语
基因电子克隆 篇3
关键词：栽培烟草；植物螯合肽合成酶；镉转运
中图分类号： Q785；S572.01文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）06-0034-04
收稿日期：2013-09-11
基金项目：贵州省科技厅农业攻关项目（编号：黔科合NY字[2011]3047号）；中国烟草总公司重点项目（编号：中烟办[2010]221号）；中国烟草总公司重大专项（编号：中烟办[2012]146号）。
作者简介：付强（1984—），男，贵州赤水人，博士，助理研究员，主要从事烟草遗传育种与蛋白质组学研究。E-mail：nesta1984fu@sina.com。
通信作者：任学良，男，博士，研究员，研究方向为烟草基因组学。E-mail：renxuel@126.com。当环境受到镉污染后，镉便在生物体内富集，并通过食物链进入人体而引起慢性中毒。镉被人体吸收后，可在人体内形成镉硫蛋白，并选择性地蓄积在肝、肾中，其中肾脏可吸收近1/3，是镉中毒的“靶器官”。镉在人体内的生物半衰期达到30年之久，往往会引起慢性毒性[1]。通過对我国烟叶主产区的重金属含量调查发现，镉是我国烟叶中的主要重金属元素，含量远高于铅、汞、砷等，平均含量达到2.95 mg/kg[2]。随着人们对健康生活关注度的提高，烟草中镉含量已经成为烟草行业关注的热点。
烟草中的镉来源于土壤，即便是在镉污染不是很严重的土壤中，烟草仍然能够通过根吸收镉，然后被吸收的镉再通过一些转运蛋白进入烟草的各个组织，从而导致镉在烟草中大量富集；此外，植物中负责转运锌、铁金属离子的转运蛋白也有运输镉的功能[3]。植物螯合肽（phytochelatins，PCS）是一种谷胱甘肽衍生的金属结合肽，在多种植物中扮演着解除镉和砷毒性的作用，近期的研究报道，植物螯合肽参与镉在韧皮部中的长距离运输。植物螯合肽的形成需要植物螯合肽合成酶的催化，而植物螯合肽合成酶基因已经成功在植物、真菌和线虫中得到克隆[4-8]。但是植物螯合肽在栽培烟草中是否存在仍然未知，并且如果在烟草中存在，其在镉代谢过程中扮演的角色也值得研究。
电子克隆（in silico cloning）是近年来伴随着基因组计划和 EST 计划而发展起来的新的基因克隆方法[9-12]，其技术核心是利用生物信息学技术组装延伸ESTs序列，获得基因的部分乃至全长cDNA序列。本研究采用电子克隆的方法获得了1个植物螯合肽合成酶基因（NtPCS1），并对其进行生物信息学分析，为进一步研究烟草中镉的转运代谢奠定了基础。
1材料与方法
1.1试验材料
本研究中所用烟草的基因序列均由GenBank提供。
1.2烟草PCS1基因的电子克隆
以马铃薯的phytochelatin synthases 1（PCS1）基因全长cDNA序列（GenBank登录号：AJ548472.1）为信息探针[13]，对GenBank中EST_others数据库的普通烟草（Nicotiana tabacum）进行BLAST检索，并参考菲莫公司的林烟草和绒毛状烟草的全基因组测序结果[14]，使用Codon Code Aligner软件对检索到的来自美国普通烟草的全部EST序列进行拼接，形成重叠群（contig）。利用拼接获得的重叠群作为探针，再次进行同源检索、拼接。重复以上过程直至没有更多的EST被检出，最终获得美国普通烟草的PCS1 cDNA序列，最后再用此序列片段在GenBank中进行BLAST比对，分析与其他物种同源基因的相似性和一致性，检验拼接所得cDNA片段的正确性以及读码框（open reading frame，ORF）序列的完整性。
1.3烟草PCS1基因的生物信息学分析
序列比对、ORF查找和翻译均在 NCBI网站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）提供的相应模块上完成。利用 ExPASy 网站上的Prot-Param、pI/Mw操作对蛋白质的理化性质进行基本分析；利用在线资源SignalP 4.1、TargetP 1.1、NetOGlyc 4.1、NetNGly 1.0、NetPhos和SOPMA软件进行信号肽、糖基化位点、磷酸化位点和蛋白二级结构的分析；利用clustalX 2.0、MEG A4.0软件进行氨基酸序列比对和进化树分析。
2结果与分析
2.1烟草栽培品种PCS1基因的电子克隆
利用马铃薯PCS1基因的全长cDNA序列（GenBank登录号：AB559522）为检索探针，对GenBnak中的烟草EST数据库进行BLAST检索分析，同时比对菲莫公司2013年发布的烟草基因组测序数据[14]，发现18条一致性和相似性较高的EST序列。按照“1.1”所述方法进行重叠群分析，结果显示，18条EST可拼接成1条独立的cDNA序列，长度为1 596 bp，暂命名为NtPCS1（Nicotiana tabacum PCS1））。
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2.2NtPCS1蛋白的基本参数和可能的翻译后修饰
NtPCS1蛋白的长度为531个氨基酸，分子量为
58.36 kDa，等电点（pI）为 6.44。在氨基酸组成上，酸性氨基酸（天门冬氨酸+谷氨酸）有56个，占10.5%；碱性氨基酸（赖氨酸+精氨酸）有52个，占9.7%；含量最丰富的为亮氨酸（Leu），占总氨基酸的11%，其次是丝氨酸（Ser）、丙氨酸（Ala），分别占8.9%、8.1%。NCBI保守域检测表明，NtPCS1蛋白含有 2 个保守域Phytochelatin_C和Phytochelatin，说明所克隆的NtPCS1 基因是植物螯合肽合成酶基因家族成员）。分析还表明：NtPCS1蛋白质不稳定指数为41.79，属于不稳定蛋白；脂溶指数为88.53，总平均亲水性（grand average of hydropathicity，GRAVY）为-0.087，具有轻度疏水性。采用 SignalP 4.1对NtPCS1蛋白进行预测[15]表明，NtPCS1蛋白无信号肽。利用TargetP1.1在线软件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）对推导蛋白的定位特性分析[16]显示，NtPCS1 没有特殊的定位偏好性。用NetOGly 4.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/）和NetNGly 1.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）进行预测的结果表明，NtPCS1 没有信号肽，即便是具有5个O-糖基化位点，也不会发生O-连接糖基化，但是在第64、154、323位氨基酸可能发生N-糖基化，这3个糖基化位点位于NtPCS1蛋白质的保守功能结构域里，对蛋白的功能可能起着重要作用。NetPhos2.0 （http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）预测表明，NtPCS1蛋白存在20个磷酸化位点，其潜在的Ser、Thr、Tyr活性位点数分别为 14、4、2个。NtPCS1蛋白存在着丰富的磷酸化位点，说明磷酸化位点修饰对PCS家族的蛋白活化起着重要作用。
2.3NtPCS1蛋白的二级结构分析
通过SOPMA方法预测的NtPCS1蛋白质的二级结构如图3所示。可以看出，参与α-螺旋的氨基酸含量达到501%（266 个）；177 个氨基酸可能参与形成无规则卷曲，占33.3%；另外有55个氨基酸可能参与延伸链，占10.4%；33个氨基酸可能参与β-转角，占6.2%。以上分析表明，α-螺旋和无规则卷曲是NtGT5a蛋白质的主要结构。
2.4NtPCS1基因同源性分析和系统进化树分析
为了分析NtPCS1与其他植物的植物螯合肽合成酶基因的同源性，在NCBI数据库中对NtPCS1进行了BLASTN。结果表明，NtPCS1与番茄的StPCS1、StPCS18、StPCS16、StPCS19和山莴苣的LsPCS1基因具有较高的核苷酸序列同源性，说明该基因应该是一个与重金属离子的吸收转运相关的新基因。同时BLASTP分析发现，NtPCS1所编码的蛋白质氨基酸序列与番茄同源基因的氨基酸相似性最高，达到85%以上；与树烟草相比，NtPCS1在N端多出30个氨基酸[4]。另外研究表明，NtPCS1与葡萄、蓖麻、可可、杨树、大豆、拟南芥的植物螯合肽合成酶基因也有较高的同源性，同源性分别为73%、68%、68%、67%、63%、60%。从GenBank上获得的多个植物PCS同源基因编码蛋白的氨基酸序列，经过clustalX 2.0比对后生成aln比对文件，然后利用进化分析软件MEGA 4.0，并采用中邻位相接（Neighbor-Joint）算法构建系统进化树[17-18]。分析结果表明，栽培烟草中的PCS蛋白与茄科植物PCS基因编码蛋白的进化关系更近；而在同科植物中，与树烟草、番茄和马铃薯的同源基因相比，烟草栽培品种的PCS蛋白与树烟草的PCS蛋白同源性更高，在进化关系上更近。
3结论与讨论
许多研究表明，植物螯合肽在植物解除重金属的毒性方面具有重要作用。Grill等早在1987年发现，在10多种高等植物中，PCS能结合植物所吸收的90%镉[19]。还有研究发现，PCS通过与植物根部吸收的镉形成复合物，能够减少镉离子对植物的毒害，从而增强植物抵抗镉胁迫的作用。
相较于其他高等植物，烟草具有更强的镉吸收累积特性，这与烟草对污染土壤中镉胁迫产生的耐性有关。Davis的研究表明，当土壤镉含量为69mg/kg时，烟草植株中镉的含量
是菠菜、莴笋的3倍[20]。烟叶中的重金属含量是由其生存的土壤中带入，而不是在生产加工过程中人为添加，而土壤中的镉、镍、铅等重金属元素的含量和pH值是呈负相关的，因此土壤越酸，重金属的含量也就越多。西南地区是我国酸雨最严重的地区，贵州的贵阳、都匀等地的酸雨量则更为严重，1982年都匀城区曾监测到降水pH值为3的惊人记录，因此这些地方的重金属含量有可能较高。吸烟时重金属对人体的危害，大大高于消化道的吸收量，因为在香烟不完全燃烧时即发生了一系列热分解与热合成化学反应，燃烧时的高温便将烟草中的重金属、类金属衍变为烟尘和雾（气溶胶），并直接由人体呼吸道进入体内，该过程包含了吸烟者和被動吸烟者，因此烟草中镉含量已经成为健康等领域关注的热点。
已有文献报道在植物中表达与PCS1合成途径相关酶的基因，能够增加PCS1的含量，并且提高植物对重金属的抗性和累积量[21]。本研究通过电子克隆方法从烟草栽培品种中克隆到1个植物螯合肽合成酶基因（NtPCS1），为利用此基因培育低镉富集的植物奠定理论基础。
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猪APOBEC3F基因电子克隆 篇4
猪APOBEC3F基因电子克隆
从EST序列着手直接寻找新基因,即利用计算机进行同源性和一致性分析、寻找感兴趣的.EST、构建包含着KST的重叠群,再进行ORF判定以及蛋白质同源性分析.最终利用生物信息学技术克隆获得了猪的APOBFE3F序列.
作 者：吴小霞 马义才 WU Xiao-xia MA Yi-cai 作者单位：吴小霞,WU Xiao-xia(琼台师范高等专科学校,海南,海口,571100)马义才,MA Yi-cai(电子科技大学生命科学与技术学院,四川,成都,610054)
刊 名：生物信息学 ISTIC英文刊名：CHINA JOURNAL OF BIOINFORMATICS 年，卷(期)： 6(3) 分类号：Q959.842 关键词：猪 ESTs APOBEC3F 电子克隆基因电子克隆 篇5
在生物体内ATP的动态平衡有赖于2条合成途径, 即从头合成途径和补救途径, 在补救途径中, 同样存在2种腺嘌呤转变为AMP的方式: (1) 腺嘌呤磷酸核糖基转移酶 (APRT, EC2.4.2.7) 催化的一步反应方式; (2) 连续由核苷磷酸化酶、腺苷酸激酶催化的方式。体内标记试验证明:植物体内一步催化方式是补救途径的重要方式, APRT是补救途径中的1个关键酶。从拟南芥、水稻、小麦、大麦、番茄和蔷薇中都分离克隆了该酶的编码基因[3]。
有研究表明拟南芥中APRT基因突变导致APRT酶活性降低, 细胞分裂素水平下降, 突变体呈明显的雄性不育[4,5], 并显示APRT参与细胞分裂素的代谢[6]。该研究利用RACE技术扩增全基因的优点和丰富的EST数据资源, 结合生物信息学的方法首次报道了玉米APRT基因的克隆和序列分析。
1 材料与方法
1.1 供试材料
玉米种子齐319由山东农业大学陈翠霞教授提供, 种子催芽后, 播种在湿的砂土中, 2周后取幼苗叶片, 用于玉米APRT基因的克隆。
1.2 APRT保守区域的引物设计
通过美国国家生物技术信息中心 (NCBI) 数据库网站搜索得到拟南芥 (A.thaliana) 、小麦 (Triticum aestivum) 、大豆 (Glycine max) 、大麦 (Hordeum vulgare) 、水稻 (Oryza sativa) (Genbank登录号分别为X96866、U22442、AI522952、AB012046、AY238894) 的APRT基因的c DNA序列, 运用DNAMAN软件进行多序列的同源比对, 得到该基因的保守区域, 并根据此保守区设计一对引物:MAP1 5′ATCATGTTC AACGACATCACGG 3′;MAP2:5′ACTTAGGAAGGCCAATGA GG 3′。由上海Sangon生物工程公司合成该引物。
1.3 玉米总RNA的提取和m RNA的纯化
取2 g玉米幼苗叶片, 经液氮研磨成粉状, 玉米总RNA的提取参照张劲松等[7]的方法进行, m RNA的纯化用Promega公司的Poly Atract systemⅢ试剂盒。
1.4 c DNA的合成及核心序列扩增
取5μg经DNase I处理的m RNA样品, 用Super ScriptTM II RNase H-Reverse Transcriptase (Invitrogen公司) 进行逆转录, 获取第1链c DNA。用设计的引物MAP1和MAP2进行PCR扩增, 反应程序如下:94℃预变性4 min;94℃, 1min, 59℃, 1 min, 72℃, 1 min, 32个循环;最后在72℃, 保持10 min。回收扩增产物并送上海博亚公司测序。
1.5 3′和5′RACE扩增
根据玉米APRT核心测序结果分别设计基因特异性RACE引物, 引物序列为3GSP:5′-CGTCGCAGGCATTGAAG CTAGAGGATTC-3′;3NGSP:5′-GGGAGCGCGTAGTGGTTGT CGATG-3′;5GSP:5′-AATGAGGCATGCACACTCAACCACGT T-3′;5NGSP:5′-GCTCCTATGGCTAGCGCAATGGCTGG-3′;amplification kit说明书进行。其中第一轮PCR反应循环参数为94℃, 30 s, 68℃, 30 s, 72℃, 2 min, 30个循环。第二轮巢式扩增循环参数为94℃, 30 s, 68℃, 30 s, 72℃, 2 min, 5个循环;94℃, 30 s, 65℃, 30 s, 72℃, 2 min, 30个循环。扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶上电泳分析。
1.6 DNA片段回收及克隆
在紫外灯下切下含目的片断的凝胶块, 用宝生物 (大连) 回收试剂盒回收DNA, 回收片断克隆到p MD18-T载体上。
1.7 序列分析
序列测定由上海博亚生物技术公司在ABI3700型测序仪上进行, 用DNAMAN和DNASTAR软件进行序列拼接, 相似性比较和聚类分析。
2 结果与分析
2.1 玉米APRT基因的克隆
根据Gen Bank中拟南芥、水稻、小麦、大豆、大麦等植物的APRT基因保守序列设计的引物MAP1和MAP2, 以反转录得到的c DNA为模板, 进行RT-PCR得到一个406 bp的扩增片段 (图1a) , 测序结果 (图2中下划线部分) 输入NCBI数据库中进行BLAST, 发现它和这些植物的APRT基因有很高的序列同源性。
以3GSP和UPM作为引物, 进行3′端的第一轮扩增, 再把第一轮扩增产物稀释40倍作为模板, 3NGSP和NUP为引物做巢式扩增, 最后获得1条带有poly A尾巴的577 bp片断 (图1b-2) 。同样5′端分别以5GSP和UPM, 5NGSP和NUP进行第一轮和巢式扩增, 得到1个509 bp的条带 (图1b-4) 。序列测定及分析表明, 扣除引物设计的重复序列, 3′, 5′端RACE反应分别延伸了452、344 bp, 拼接获得的玉米APRT基因c DNA序列总长为1 202 bp, Gen Bank登录号为AY485263。该c DNA包含1个642 bp的开放阅读框 (ORF) , 编码214个氨基酸。翻译起始于第169个碱基, 终止于第814个碱基, 3′端389 bp非编码区含有27个poly A。初步证明我们已经克隆了玉米APRT基因的全长c DNA。
将玉米APRT基因的c DNA序列在Maize GDB (美国玉米遗传与基因组数据库) 中BLAST, 搜索到6个ESTs有很高的序列相似性, E-value值为0。它们分别是3529_1_122_1_H11.y_1, 1117022F09.y1, 1000052F06.x2, 3529_1_122_1_H11.x_1, 707008C07.x3, 946168F01.y1 (Gen Bank登录号分别是CD527756、CA831697、BF727777、CD572916、AW289078、BU572174) 。分析表明:3529_1_122_1_H11.y_1, 1117022F09.y1在玉米APRT基因序列5′端58-680的位置, 而1000052F06.x2, 3529_1_122_1_H11.x_1, 707008C07.x3, 946168F01.y1则覆盖了玉米APRT基因序列3′端488~1 041的位置。这5个ESTs重叠区域覆盖了这个基因序列58~1 041的位置, 进一步证实我们已获得这个基因的全序列。说明利用ESTs设计全长引物的常规电子克隆难以获得完整3′端、5′端序列, 结合RACE技术则可以解决这个问题。
2.2 玉米APRT基因的氨基酸序列分析
将根据玉米APRT基因推测的氨基酸序列在NCBI中进RPS-BLAST (reverse position specific BLAST) 保守域查询, 发现它具有腺嘌呤磷酸核糖基转移酶 (APRT) 的保守域 (97.8%aligned, Score=250, Expect=1e-67) 。再将推测的氨基酸序列在Gen Bank数据库进行氨基酸相似性比对 (BLAST分析) , 结果表明它与水稻2型、小麦1型、小麦2型、大麦、拟南芥1型、拟南芥2型的APRT蛋白一致率分别为79%、56%、75%、56%、52%、56%, 并且它们都含有嘌呤结合域和磷酸核糖焦磷酸结合域 (图3) 。该结果证明克隆到的玉米APRT基因是APRT基因家族的一个成员。比较发现玉米APRT蛋白与水稻、小麦、拟南芥的2型同源性都比它们对应的1型高, 故可认为克隆的玉米APRT基因应该属于2型, 因此将其命名为Zm APT2。
注:a:核心片断RT-PCR的扩增产物 (箭头所示) ;b:泳道1、2分别是3′RACE第一轮和巢式PCR扩增产物, 3、4分别是5′RACE第一轮和巢式扩增产物。M为DNA分子标记DL2000。
注:下划线序列为RT-PCR扩增的核心区域, 黑斜体序列为起始密码子和终止密码子。
在BLAST分析的基础上, 选择10种具有代表性APRT蛋白与Zm APT2蛋白用UPGMA方法进行聚类分析 (图4) 。10种APRT蛋白被分为5个大分支, 所有植物的APRT蛋白组成1个分支, 其中玉米的Zm APT2与水稻2型同源性最高, 而来自动物和细菌的APRT蛋白分别组成了另外4个分支。可见在植物中APRT具有高度的保守性, 属持家基因家族表达的酶。
注:图中APRT缩写:ZM2:玉米APRT 2型 (Zm APT2, Gen Bank登录号AY485263) ;OS2:水稻APRT 2型 (Os APT2, Gen Bank登录号AY238894) ;TA1、TA2:小麦APRT 1型、2型 (Ta APT1、Ta APT2, Gen Bank登录号分别为U22442, AY255503) ;AT1、AT2:拟南芥APRT 1型、2型 (At APT1、At APT2, Gen Bank登录号分别为X58640, X96866) ;HV:大麦APRT (Gen Bank登录号AB012046) 。
3 讨论
尽管各类生物体千差万别, 分子水平上的进化变异也很大, 但不同生物体内功能相同的基因在结构及序列上有很大的保守性, 这是生物体保持其相对稳定、生存和发展的根本。在植物抗病基因克隆中同源序列扩增法分离基因已展示了其应用价值。目前已成功地从12种单子叶和双子叶植物中分离了NBS-LRR基因。但同源序列扩增法较多用于筛选c DNA文库或基因组文库, 近来电子克隆技术因具有投入低、速度快、技术要求低和针对性强等优点, 受到高度重视, 并开始得到了初步的应用。如O′Brien et al[8]以EST数据库为基础电子克隆了5个人类新基因C11orf1-C11orf5。张德礼等[9]采用生物信息学方法克隆了人类SR蛋白新基因, 并结合RT-PCR进行了验证。黄冀等[10]也用此法克隆了水稻的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因Os G6PDH。生物信息学数据库和生物分析软件的飞速发展, 大大提高了分离克隆基因的速度, 全长c DNA克隆是新基因功能研究及生物产品开发的前提, 有助于了解基因在转录后复杂的变异形式。一些作物如小麦、玉米的基因组庞大, 重复序列多, 用常规的图位克隆法难以克隆基因, 现在也可以借助丰富的EST序列资源与RACE结合的电子克隆方法快速获得目的基因全长c DNA。
该研究中运用同源序列设计引物再结合RACE技术克隆了玉米腺嘌呤磷酸核糖基转移酶 (APRT) 基因, 最后通过EST数据库进行验证。这不仅发展了常规的电子克隆方法, 也是一种更为准确、有效的全长c DNA克隆方法。
目前在植物中对拟南芥腺嘌呤磷酸核糖基转移酶 (APRT) 的研究较多, 已经从拟南芥中克隆了3种形式APRT的c DNA, 其中APRT2对细胞分裂素有更高的亲合力, 有明显的花芽表达专一性[11,12]。一些腺嘌呤类似物在APRT催化后产生有毒性的核苷酸, 这已经被用来分离APRT缺失的突变体。在拟南芥中运用这种方法鉴定了2, 6-二氨基嘌呤抗性突变体, 这些突变体APRT酶活性还达不到其野生型活性的1%, 而且它不能转变细胞分裂素苄基腺嘌呤为核苷酸, 说明APRT也参与了这个转变过程, 突变体长的矮小而且缺少活力, 表现雄性不育[6]。Gaillard et al[5]进一步证实在拟南芥不育突变体BM3中, 细胞分裂素代谢变弱, APRT活性下降。细胞分裂素降低也是不育花粉中的一种较普遍现象, Shukla et al[13]等发现在油菜中雄性不育的叶片中表达的腺嘌呤还不到其野生型叶片的50%, 并认为细胞分裂素氧化酶 (CKOs) 和APRT参与了细胞分裂素的代谢途径。因此, 极有可能植物体的雄性不育性与该代谢途径的变化有关, 如果能测定在生殖器官中APRT活性变化, 结果将比叶片的结果更有说服力。张建奎等[14]研究发现小麦育性转换与幼穗中APRT基因转录水平有一定关系。LI et al[15]的研究表明, 水稻温敏核不育系“安农S-1”在高温下Os APT2活性在根、茎、叶中变化不大, 而在小穗中APRT活性下降5倍。高温导致在幼穗中Os APT2下调表达, 而对根、茎、叶中的Os APT2表达无明显影响, 结果有力地表明Os APT2可能与水稻“安农S-1”的温敏雄性不育有关。
绵羊早孕因子基因部分序列的克隆 篇6
1 材料与方法
1.1 主要试剂
反转录试剂盒、PCR扩增试剂盒DNA、Marker DL2000和Rnase抑制剂等购自大连Ta Ka Ra公司;Trizol Reagent购自Invitrogen公司。
1.2 试验材料
挑选怀孕5、80和130d的绵羊各3只, 取血液2m L, 于3000rpm离心15min, 得到血清。按照Trizol试剂盒提供的步骤提取绵羊血清中的总RNA, 取5μL用1%琼脂糖凝胶电泳 (120V, 20min) 检查其完整性、含量和纯度, 使用核酸蛋白测定仪测定其浓度。
1.3 试验方法
1.3.1 引物设计
参照Gen Bank公布的EPF基因序列和文献报道[1], 用Primer Premier5.0软件设计扩增EPF基因的一对上下游引物:
上游引物F:5'-ATGGCTGGACAAGCTTTTAG-3’
下游引物R:5'-GAAATATGGAGATTATCTAC-3’
1.3.2 PCR扩增
将提取的总RNA, 按照Ta Ka Ra公司反转录试剂盒方法进行c DNA第一链的合成。反转录程序为:37℃15min, 85℃5s以反转录产物为模板, 以特异引物进行PCR扩增。PCR反应体系为25μL (无菌水17.25μL、c DNA2μL、特异上下游引物各0.5μL、Taq E 0.25μL、d NTP2μL、10×buffer2.5μL) 进行PCR扩增。PCR产物用2%的琼脂糖凝胶检测。扩增产物经纯化后送交大连宝生物工程有限公司双引物测序。
2 实验结果
2.1 PCR产物电泳结果
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测, 显示出在400bp左右有一条特异性的条带, 与预期大小相符。
M.DNA maker 2000;1、2和3分别是怀孕5、80和130d的绵羊RT-PCR产物
2.2 PCR产物测序结果
PCR产物割胶回收后送交生物公司测序, 测序结果如下 (方框中的序列为引物序列) :
3 讨论
早孕因子 (early pregnancy factor, EPF) 是哺乳动物受精后最早在血清中检测到的具有免疫抑制和生长调节作用的妊娠相关蛋白1974年。首次由澳大利亚外科医生Morton在早孕大鼠血清中首次发现, 由于其在小鼠交配6h后就可检测到, 因此被命名为早孕因子。早孕因子的氨基酸序列包括102个氨基酸残基, 耐热, 耐透析, 对温度、酸碱度的耐受性较强。在低于56℃时很稳定, 但一旦超过72℃时容易失活。EPF作为一种免疫抑制因子和生长因子发挥生理学作用: (1) EPF具有抑制母体的免疫反应而使胚胎免受免疫排斥的作用, 在着床前后是胚胎生长及存活所必需, 它的存在保证了胚胎的良好状态, 它是目前最早确认妊娠的生化标志之一; (2) 生长调节:EPF能促进肿瘤细胞的生长, 也能促进烧伤、溃疡等伤口的愈合。
研究表明, 小鼠交配后6h, 兔交配后16h, 大鼠、绵羊、牛、猪、羊交配后24h, 人受精48h即可从母体内测出EPF。检出妊娠远早于人绒毛膜促性腺激素测定方法, 相关文献报道表明EPF的活性在妊娠期存在时间比较长, 在人持续到妊娠6个月, 在小鼠可持续至产仔前4d, 绵羊、猪几乎持续整个孕期, 并且发现猪在怀孕3~4周时EPF活性最高, 但卵子如果未受精则测不出EPF。EPF在孕妇的血液检测可用于超早孕诊断, 准确率达88.6%。到目前为止, 利用EPF检测妊娠局限于蛋白的测定, 主要运用免疫反应进行检测, 其费用较贵。本实验成功扩增出绵羊的EPF基因的部分序列, 并且得出在绵羊怀孕的第5天就可检测出EPF的表达, 同时得出在整个孕期都有EPF的存在。这为进一步利用分子生物学手段检测妊娠提供了理论的依据。
参考文献
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基因电子克隆 篇7
目前, 根据功能可以将r-蛋白分成2类:在第一类中, r-蛋白主要是核糖体的组成部分。这些蛋白的主要特点就是它们在氨基酸序列上十分保守, 但是在蛋白的合成方面也起到重要的作用。生物体内的蛋白合成需要很多r-蛋白的正确组合, 但是它们之间的组合非常复杂, 目前为止人们对这种复杂性的认识还十分肤浅[7]。在第二类r-蛋白中, 许多r-蛋白和生物对外界环境的适应有关。近年来, 在动物中发现很多和低温相关的r-蛋白, 这些蛋白对提高生物适应低温环境起到关键的作用[8]。另外, 研究表明Saccharomyces突变体对低温非常敏感, 这种敏感性与核糖体不能正确的组装有关[9]。另外, 大豆中Gmrps13、Gmrps6和Gmrps37的分离与鉴定也进一步说明了这一点[10]。
虽然许多植物中都已发现同源性很高的L34基因, 但在大豆中还没有相关的报道。本实验利用cDNA-AFLP方法从低温处理的大豆胚轴中克隆到L34基因, 并且通过RT-PCR方法研究表达的状况, 为下一步研究此基因在大豆生长发育过程中的作用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验材料
用“中黄22”大豆种子 (抗低温吸胀型种子:低温吸胀24h对其萌发率无影响) 为试验材料, 含水量为8.9%, 2006年购于中国农业科学院后放在-20℃冰箱中保存。整个试验在北京林业大学生物学院完成。
1.1.2 试剂
cDNA-AFLP所用试剂盒来自大连宝生物工程公司;PCR反应所用试剂包括Taq酶和dNTP购于大连宝生物工程公司;cDNA和克隆载体购于北京Tiangen公司;所用菌体E.coli DH5α为实验室保存菌种。
1.1.3 仪器
PCR仪、高温灭菌锅、-20℃冰箱、摇床和无菌操作台。
1.2 方法
1.2.1 cDNA-AFLP技术
选取在低温 (4℃) 和常温 (22℃) 下吸胀24 h的“中黄22”大豆种子 (Glycine max (L.) Meer.) 胚轴作为材料, 利用试剂盒提取胚轴的总RNA (Qiagen, Germany) 后再利用M-MLV RTase cDNA合成试剂盒 (TakaRa, Japan) 合成双链cDNA。实验中cDNA-AFLP技术的流程参照Umezawa, et al. 2002[11]和Liang, et al. 2005[11]。使用6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PCR产物, 然后利用硝酸银染色, 显色。基因分离后, 使用刀片切取差异条带并置于0.5mL离心管中, 加入40ml无菌水置入100℃沸水中5min, 取上清液作为模板再进行PCR, 最后进行基因的克隆和测序。
RT-PCR验证基因片段:引物序列为:上游:5′-GCGATTTATGCAAATCGT-3′;下游:5′-CACAACAGGTTTAACCATAG-3′。PCR反应程序为:94℃ 10min; 94℃ 1min, 50℃ 1min, 72℃ 1min;共30个循环;72℃ 10min。最后, 利用生物信息软件对基因片段的序列进行分析以及利用5′和3′RACE技术获得全长基因, 实验进行3次重复。
1.2.2 SOL34基因在大豆胚轴中的表达分析
大豆种子分别放在22℃、4℃下吸胀24h。此期间分别在0h、6h、12h、18h和24h研究基因在大豆胚轴中的表达模型。RNA的提取和cDNA的合成与上述相应方法相同。基因的引物为, 上游:5′-GGAAGAAGCTGATCGGAGAA-3′;下游:5′-CCAAACCTAA AATCCCTCCAA-3′。Tubulin作为内参, 内参引物为, 上游:5′-AACCTCCTCCTCATCGT ACT-3′;下游:5′-GACAGCATCAGCCATGTTCA-3′。PCR反应程序为:94℃ 下5min; 94℃ 1min;52℃ 1min;72℃ 1min;共35个循环;72℃ 10min。实验进行3次重复。
2 结果与分析
2.1 基因的分离与鉴定
利用cDNA-AFLP技术从抗低温吸胀的大豆种子中分离出一个受低温诱导的基因片段, 其长度为275 bp (图1) , 并且命名为SOL34基因。利用RT-PCR方法对SOL34的表达做进一步验证, 结果表明:大豆胚轴在4℃下吸胀24h后, SOL34的表达量约为22℃下吸胀24h表达量的5倍 (图2～3) , 因此可以确定SOL34基因受低温诱导。
2.2 基因序列分析
利用RACE方法得到基因的全长后我们发现全长的SOL34基因为360bp, 它能够编码120个氨基酸残基。经过在NCBI数据库中查询后, 我们发现SOL34基因和拟南芥、水稻、烟草等植物中的核糖体蛋白L34基因具有较高的同源性, 同源性高达95%以上, 并且含有高度保守的结构域, 所以可以确定SOL34是60S核糖体的组成成份。
2.3 基因表达分析
从图4中看出, SOL34基因在22℃下吸胀24h的表达量很低, 但是在4℃下, 表达量发生显著的变化。4℃下吸胀6h后, SOL34基因的表达量明显比22℃下的高, 18h后几乎达到最大值。另外, 图5表明, 低温处理能够诱导根尖和胚轴中SOL34基因的表达, 根尖在低温 (4℃) 处理的情况下, SOL34的表达量为非处理3～4倍, 胚轴中约为5倍左右。但是SOL34在叶片中的表达不受低温影响, 表达量在处理和非处理材料中没有显著的差异。另外, 即使是在非处理的条件下, 根尖中SOL34的表达也要高于非处理胚轴和叶片, 暗示SOL34的表达可能和大豆根的代谢有关。
a.SOL3422℃;b.SOL344℃下不同时间的表达;c.大豆内参基因 (Tubulin) 在不同时间内的表达。a.Temporal expression of SOL34 during imbibition at22℃;b.Temporal expression of SOL34 during imbibition at4℃;c.Temporal expression of SOL34 during imbibition.
3 讨论
大豆是世界上广泛种植的作物之一, 其营养价值也越来越受到人们的关注, 所以近年来无论从生理生化还是从分子角度都受到很多学者的青睐。cDNA-AFLP是一种非常有效的分离基因的方法, 因为利用此方法分离基因不用完全清楚材料的遗传背景[13]。近些年来, 科学工作者分别从柑橘大豆和中分离出受低温[11,14]和盐胁迫诱导的基因[12], 进一步研究表明这些基因的表达能够提高植株对胁迫环境的适应能力。本实验利用cDNA-AFLP方法从低温吸胀24h的大豆胚轴中克隆到一个受低温诱导的核糖体蛋白基因 (SOL34) 。分析表明, 此基因能够编码132 kD的蛋白, 是60S核糖体蛋白的组成部分。到目前为止, 很多生物中的SOL34基因都得到了分离, 例如在鱼[15]、蟾蜍[16]和螺旋体[17]中都发现了L34基因的存在。研究表明, L34基因在生物中高度保守, 并且已多拷贝形式存在染色体上, 暗示此基因在生物代谢过程中起到非常重要的作用。但是SOL34基因在大豆基因组中是否以多拷贝形式存在还不清楚。
a.SOL34基因在大豆不同部位表达的研究;L:非处理的叶片;L (t) :低温处理的叶片;R:非处理的根尖R (t) :低温处理的根尖;S:非处理的胚轴;S (t) :低温处理的胚轴.b.大豆内参基因 (Tubulin) 在不同部位的表达。a.Spatial expression of SOL34 gene in soybean;L:Leaf without treatment;L (t) :Leaf with treatment;R:Root tips without treatment;R (t) :Root tips with treatment;S:Embryonic axis without treatment;S (t) :Embryonic axiswith treatment.b.Spatial expression of tubulin gene in soybean.
基因电子克隆 篇8
关键词：杨树;EBP1基因;克隆;表达载体;构建;基因序列分析;蛋白同源性比对
中图分类号： Q943.2 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2015）04-0014-03
收稿日期：2014-05-25
基金项目：天津市高等学校科技发展基金（编号：20120619）;天津市应用基础与前沿技术研究计划（编号：14JCQNJC15000）。
作者简介：李 慧（1981—），女，河北廊坊人，硕士，讲师，主要从事植物分子生物学研究。E-mail：lihui@tjau.edu.cn。
通信作者：阎国荣，博士，教授，主要从事植物资源学研究。E-mail：yanguorong@eyou.com。
自然界中植物种类繁多、形态各异，其中器官大小是造成植物形态多样性的主要因素之一。不同植物间器官大小可能存在显著差异，但就同一物种内相同基因型的不同植物个体而言，在相同的生长环境下它们的器官大小基本一致，表明植物各器官最终大小的形成受到严格的遗传调控[1]。因此，近年来从不同植物中挖掘参与器官大小发育调控的基因或转录因子并揭示其调控机制的研究备受关注，并已在拟南芥和一些农作物如水稻、玉米、油菜、番茄、马铃薯等中取得了长足的研究进展[1-2]。有研究发现，在外界生长条件一致的情况下，植物各器官的最终大小在细胞水平上受细胞数量和大小的协同控制[3]。因此，分离、克隆参与调控植物细胞数量和大小的基因并阐释其功能是揭示植物器官大小发育控制机制的关键。目前，在拟南芥等草本植物中已有多个相关基因和转录调控因子被成功分离和克隆。有研究表明，AINTEGUMENTA（ANT）[4]、ANGUSTIFOLIA3（AN3）[5]、GROWTH-REGULATING FACTOR5（AtGRF5）[5]、GRF-INTERACTING FACTOR（GIF）[6-7]、JAGGED（JAG）[8]、STRUWWELPETER（SWP）[9]、SWELLMAP1（SMP1）[10]、KLUH（KLU）[11]、EBP1[12]及Auxin-Regulated Gene involved in Organ Size（ARGOS）[13-14]等主要通過正向调控细胞增殖能力控制器官内细胞数量，进而影响器官大小。这些基因的异位过表达可通过延长细胞增殖时间导致植物器官变大，而突变则会导致植株器官整体变小。另外，还有一些基因通过调控细胞大小来影响器官的大小，如ARGOS-LIKE（ARL）[15]、ROTUNDIFOLIA3（ROT3）[16]、AtGRF1/2[17]、BIGPETAL[18]、AtTOR[19]、ORGAN SIZE RELATED1（OSR1）[20]等，其中拟南芥中EBP1被证实对植物细胞数量和大小均能发挥正向调控作用[12]。拟南芥EBP1是和人类的ErbB-3表皮生长因子受体结合蛋白同源的一个基因，与核糖体的生物合成相关，该基因在进化上具有较高的保守性。目前除在拟南芥外，在沙冬青和马铃薯中也有该基因序列的相关报道，但该基因在其他植物中的功能仍未知，特别是在木本植物中，尚未有该基因的相关报道。因此，本研究对杨树中EBP1基因进行克隆，并对其表达载体进行构建。相关研究对进一步揭示杨树EBP1的功能具有重要意义，同时对采用基因工程等手段提高林木产量和品质具有潜在的应用价值。
1 材料与方法
1.1 试验材料
黑杨（Populus nigra），种植于南开大学校园内;pEASY-T1载体，购于北京全式金生物技术有限公司;植物表达载体pBI121、农杆菌LBA4404，均由笔者所在实验室保存。
1.2 方法
1.2.1 黑杨总RNA提取及反转录 采用改良的CTAB法提取黑杨叶片总RNA，以Oligo dT（18）为逆转录引物，在 M-MLV 作用下逆转录成cDNA。
1.2.2 引物设计及同源克隆 以拟南芥及其他草本植物中已经报道的EBP1基因DNA及cDNA序列为种子序列，利用Blast序列比对软件搜索杨树基因组及EST数据库，获得杨树中候选EBP1基因序列。随后根据筛选、获得的杨树中EBP1候选序列设计引物，进行扩增，并对扩增结果进行测序验证。进一步对NCBI数据库中收集的杨树EBP1相关EST序列进行分析，结合测序结果，对杨树中EBP1基因全长cDNA序列进行克隆及序列分析。
1.2.3 杨树EBP1表达载体构建及分子鉴定 根据已获得的杨树EBP1候选基因全长cDNA序列，设计带有酶切位点的全长cDNA扩增引物，对EBP1全长cDNA进行扩增及 T-A 克隆。挑取含有杨树EBP1全长cDNA的阳性克隆，放大培养并提取质粒，通过双酶切获得带有黏性末端的EBP1全长cDNA序列。进而与经过相同双酶切的植物表达载体pBI121采用T4连接酶进行连接，最终获得EBP1重组表达载体。将重组载体转入大肠杆菌感受态细胞，在LB+卡那霉素（Kan）板上筛选阳性克隆进行菌液PCR和酶切验证，进而获得插入方向和序列完全正确的阳性克隆。随后将该阳性克隆放大培养，采用质粒提取试剂提取重组质粒，并采用冻融法将该重组质粒导入农杆菌LBA4404感受态细胞，在YEB+链霉素（str）+利福平（Rif）板上筛选阳性克隆进行菌液PCR验证。
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2 结果与分析
2.1 杨树EBP1基因的克隆
根据序列同源性分析结果，设计引物对EBP1-1F：5′-ATGTCGTCAGACGACGAGA-3′和 EBP1-1R：5′-TTCCTAGACGGCGGTGG-3′，以黑杨cDNA为模板对杨树中EBP1候选基因进行克隆。扩增结果显示，黑杨中EBP1候选基因全长cDNA约为1.2 kb（图1）。将获得的cDNA通过T-A克隆方法，连入pEASY-T载体，挑取阳性克隆进行测序。测序结果显示，杨树中EBP1基因全长cDNA序列长度为1 215 bp，将其命名为PtEBP1。
2.2 杨树PtEBP1的生物信息学分析
根据测序结果，对获得的PtEBP1进行进一步的序列分析。同源性比对结果显示，PtEBP1与已报道的沙冬青和马铃薯EBP1基因具有较高的同源性，其中与沙冬青EBP1蛋白序列的同源性为89%，与马铃薯EBP1蛋白同源性为87%（图2）。保守结构域分析结果显示PtEBP1含有1个PA2G4-like-domain，这个结构域属于APP_MetAP超家族（图3）。由此推测杨树PtEBP1基因应属于转录因子APP_MetAP超家族的一个成员。
2.3 PtEBP1表达载体的构建
为对PtEBP1的功能及作用机制进行探究，本试验进一步对PtEBP1植物表达载体进行构建。首先通过对PtEBP1的序列分析，结合pBI121载体酶切位点信息，确定选用XbaⅠ和SacⅠ对pBI121载体进行切割;随后设计带有XbaΙ和SacⅠ切割序列的引物PtEBP1-F：5′-TCTAGAATGTCGTCAGACGACGAGA-3′和PtEBP1-R：5′-GAGCTCCTAGACGGCGGTGG-3′用于扩增PtEBP1，将扩增序列通过T-A克隆方法导入pEASY-T1质粒，挑取阳性克隆并提取质粒，对质粒进行XbaⅠ和SacⅠ双酶切消化处理后，获得带有双酶切位点的目的片段，与经过同样双酶切的pBI121的载体进行连接（图4）。
上述连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，在含有卡那霉素抗性的LB平板上筛选阳性克隆，PCR检测显示阳性重组克隆中含有1.2 kb的目的片段;阳性重组克隆进一步经过XbaⅠ和SacⅠ双酶切后也能产生1.2 kb的目的片段（图5）。这表明杨树EBP1基因已成功构建入植物转基因表达载体pBI121中。
2.4 农杆菌LBA4404中表达载体的菌液PCR鉴定
采用冻融法将已构建好的表达载体pBI121-PtEBP1转化农杆菌（LBA4404）感受态细胞，在含有链霉素和利福平的YEB固体培养基上进行筛选。随机挑取4个阳性克隆进行菌液PCR，PCR扩增产物均为1.2 kb（图6），证明表达载体已成功转入农杆菌中。
3 结论与讨论
EBP1是拟南芥中和人类ErbB-3表皮生长因子受体结合蛋白同源的一个基因，与核糖体的生物合成有关，可以同时控制细胞的分裂和延伸，从细胞数量和体积2个方面同时调控植物器官大小。EBP1基因以剂量依赖型方式调节植物器官大小，同时也以生长素依赖形式对细胞周期调节因子進行调控[12]，该基因与蛋白合成密切相关，并参加调控细胞周期，在调节植物器官大小方面具有重要意义。
杨树是重要的用材和绿化树种，具有经济和生态双重价值。但和其他绝大多数木本植物一样，杨树生长周期也较长，遗传背景复杂，很难在短时间内创造出大量突变体。因此，长期以来对杨树等木本植物器官形态建成及生长发育调控机制等基本问题的研究远远落后于拟南芥等草本植物。而2006年杨树全基因组测序的完成[21]及随后不断丰富完善的杨树及其近源种的EST数据信息，为采用生物信息学手段结合反向遗传学策略探究杨树生长发育机制等基本问题提供了一条有效途径。
本研究通过克隆获得的杨树PtEBP1基因应属于转录因子APP_MetAP超家族的一个成员。通过蛋白同源性比对发现，杨树PtEBP1与已报道的与沙冬青、马铃薯的EBP1蛋白同源性高达89%、87%。同时，本研究已将杨树PtEBP1基因构建入植物转基因表达载体pBI121中，并成功转入农杆菌LBA4404中，为进一步开展杨树中EBP1类转录因子的功能研究、深度解析杨树生长发育优势形成的分子基础奠定了重要的基础。
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基因电子克隆 篇9
小麦BBC1基因cDNA的克隆与分析
从小麦(Triticum aestivum L.)中克隆了一个BBC1基因的`cDNA.分析结果表明,该基因编码一亲水多肽,富含丙氨酸、赖氨酸、精氨酸和谷氨酸.该基因的转录受低温调控.在小麦基因组中,BBC1基因以一个小家族的形式存在.
作 者：常胜合 英加 张吉军 李滨 李振声 作者单位：中国科学院遗传与发育生物学研究所,北京,100101刊 名：植物学报 ISTIC SCI英文刊名：ACTA BOTANICA SINICA年，卷(期)：45(7)分类号：Q943.2关键词：BBC1 低温诱导:普通小麦 breast basic conserved 1 (BBC1) cold induction common wheat
基因电子克隆 篇10
1材料
1.1病毒
NDV La Sota毒株,购自哈尔滨维科生物技术开发公司。
1.2载体与菌株
p Bluscript ⅡKS( + / - ) 和p ET - 28a载体,由温州科技职业学院动物科学系动物病毒研究室保存; E. coli DH5α 和BL21 ( DE3 ) 感受态细胞,购自宝生物工程( 大连) 有限公司。
1.3工具酶和主要试剂
RNA酶抑制剂、PCR反应试剂、DNA Marker ( DL - 2 000、DL - 15 000) 、Prime STAR HS DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、鼠源反转 录酶 ( M - MLV) 、 IPTG、限制性内切酶( Nde Ⅰ、Sal Ⅰ、EcoR Ⅴ) ,购自宝生物工程( 大连) 有限公司; DNA胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒,购自生工生物工程( 上海) 股份有限公司; Ni - NTA纯化树脂,购自QIAGEN公司。
1.4引物的设计与合成
参照Gen Bank中的NDV La Sota毒株基因组序列 ( 登录号为AF077761) ,利用Primer Premier 5. 0软件设计引物,引物序列: 上游引物P1 5' - GGGAATTCCATATGATGGGGGCTAGCACACCTAG - 3' ( 下画线部分 为Nde Ⅰ 酶切位点 ) ,下游引物P2 5' -ACGCGTCGACCTAGCCAGACCTGGCTTCTC - 3' ( 下画线部分为Sal Ⅰ酶切位点) 。为了扩增出去信号肽和跨膜区的HN基因( 1 593 bp) 及便于构建重组表达载体,在上、下游引物的5'端分别加入酶切位点及多个保护性碱基。引物由生工生物工程( 上海) 股份有限公司合成。
2方法
2.1NDVRNA的提取与反转录
取NDV La Sota毒株疫苗液150 μL,参照相应试剂盒说明书提取病毒RNA,然后反转录合成c DNA。 反转录体系和反应条件: RNA 22 μL,下游引物1 μL, d NTP( 2. 5 mmol / L) 3 μL,DTT 3 μL,65 ℃ 5 min; 冰水浴5 min; 然后加入5 × FS Buffer 8 μL,RNase Inhibitor 1 μL,M - MLV 1 μL,37 ℃ 水浴2 h; - 20 ℃ 保存,备用。
2.2目的基因的PCR扩增与克隆
以反转录得到的c DNA为模板,利用特异性引物进行PCR扩增。PCR反应体系: 5 × Primestar Buffer 10 μL,Primestar 0. 5 μL,d NTP ( 2. 5 mmol / L) 4 μL, 上、下游引物各1. 5 μL,Template( c DNA) 4 μL,d H2O 28. 5 μL。PCR反应条件: 95 ℃ 预变性5 min; 98 ℃ 变性10 s,56 ℃退火15 s,72 ℃ 延伸1. 5 min,共30个循环; 72 ℃终延伸10 min; 电泳鉴定PCR产物。PCR产物胶回收后与p Bluscript Ⅱ KS ( + / - ) 载体于16 ℃ 连接2 h,构建重组质粒,命名为p Blue - NDV HN; 将p Blue - NDV - HN转入E. coli DH5α 感受态细胞中,并均匀涂在含氨苄西林抗性的LB平板上; IPTG诱导17 h后挑取白色阳性菌落,37 ℃ 培养16 h; 参照相应试剂盒说明书提取质粒,将阳性质粒送生工生物工程( 上海) 股份有限公司测序。
2.3NDVHN基因表达栽体的构建与鉴定
用Nde Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切p Blue - NDV - HN,以胶回收试剂盒回收获得HN基因。
用Nde Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切p ET - 28a载体,与HN基因连接,转入E. coli DH5α 感受态细胞中,并均匀涂在含卡那霉素抗性的LB平板上。用Nde Ⅰ和Sal Ⅰ酶切鉴定重组表达载体p ET28a - NDV - HN,鉴定正确后转入E. coli BL21 ( DE3) 感受态细胞中进行表达。
2.4重组表达载体的诱导表达和重组蛋白的可溶性分析
设空载体p ET - 28a作为对照。用含卡那霉素的新鲜LB液体培养基按照1∶100比例分别稀释含p ET - 28a - NDV - HN和空载体p ET - 28a的菌液, 于37 ℃振荡培养至菌液OD600值达0. 6时,用终浓度为1. 0 mmol/L IPTG诱导5 h; 取15 m L菌液, 6 000 × g离心10 min; 弃上清液,加入结合缓冲液重悬沉淀,超声处理后6 000 × g离心分离上清液与沉淀样品; SDS - PAGE检测,确定重组蛋白是否为可溶性表达。
2.5表达产物的SDS-PAGE分析
收集菌液,4 ℃、12 000 r/min离心10 min; 收集沉淀,PBS重悬,加入等体积的2 × SDS凝胶上样缓冲液,煮沸5 min,作为SDS - PAGE电泳上样样品。按照《分子克隆实验指南》[5]中的方法进行SDS -PAGE电泳,同时以含空载体菌体和含重组阳性载体诱导前菌体作为对照。电泳完毕后取凝胶,用考马斯亮兰R250染色,脱色液脱色数次后分析蛋白的表达情况。
2.6重组蛋白的纯化
取诱导后的菌液100 m L,4 ℃、10 000 × g离心10 min; 弃上清液,向细菌沉淀中加入结合缓冲液重悬,超声破碎细胞,10 000 × g离心20 min; 收集上清液,通过Ni - NTA纯化树脂对目的蛋白进行纯化,应用SDS - PAGE对纯化蛋白进行检测。
2. 7重组蛋白的Western - blot检测
将SDS - PAGE凝胶电泳蛋白条带转印到NC膜上,用PBST ( 含0. 05% 吐温 - 20) 洗膜3次,每次3 min; 然后加入抗His - tag单克隆抗体( 一抗,按照1∶2 000比例稀释) ,室温振荡1 h; 再用PBST洗膜3次,每次3 min; 加入1 ∶5 000比例稀释的辣根过氧化酶( HRP) 标记的羊抗鼠 - 抗体( 二抗) ,室温振荡1. 5 ~ 2. 0 h; 再用PBST漂洗3次,每次3 min; 最后置DAB显色液中显色,待条带清晰后迅速用去离子水终止显色。
3结果与分析
3.1NDVLaSota毒株HN基因的克隆和pBlue-NDV-HN的构建与酶切鉴定(结果见图1~2)
1. PCR 产物; M. DL - 2 000 Marker。
由图1可知,经1% 琼脂糖凝胶电泳获得大小约为1 600 bp的目的片段,与预期结果相符。
M1. DL - 2 000 Marker; 1. 双酶切产物; M2. DL - 15 000 Marker。
由图2可知,重组质粒p Blue - NDV - HN构建成功,酶切鉴定正确的重组质粒测序验证正确。
3.2重组表达载体pET28a-NDV-HN的构建与鉴定(结果见图3)
由图3可知,酶切鉴定结果与预期大小一致,说明重组表达载体p ET28a - NDV - HN构建成功。
3.3重组表达载体的诱导表达、可溶性分析与目的蛋白纯化
SDS - PAGE检测结果表明: p ET28a - NDV - HN上清液与沉淀都在约59 ku处表达条带,与预计大小相符。诱导菌液超声离心处理后取上清液和沉淀进行可溶性分析,结果重组蛋白在沉淀和上清液中同时存在,见图4第1,3泳道。通过Ni - NTA纯化树脂对目的蛋白进行纯化,取少量纯化产物进行SDS -PAGE分析,得到较纯的1条蛋白条带,见图4第4泳道。
M1. DL - 15 000 Marker; 1. p ET28a - NDV - HN 双酶切产物; M2. DL - 2 000 Marker。
1. 细菌裂解液沉淀; M. 蛋白分子质量标准; 2. 细菌裂解液上清液; 3. 纯化重组蛋白。
3.4重组蛋白的Western-blot检测(结果见图5)
M. 蛋白分子质量标准; 1. 重组 HN 纯化蛋白。
由图5可知,在59 ku处出现1条清晰的反应条带,说明重组蛋白在大肠杆菌中得到正确表达,并且具有免疫反应原性。
4讨论
ND被世界动物卫生组织( OIE) 列为法定报告的传染病之一。NDV导致鸡群死亡率极高,强毒力毒株引起的死亡率常达100% ,并且广泛分布于世界许多国家。幸免存活的禽类出现生长障碍、产蛋量减少及软皮蛋的现象,这给全球养禽业造成了严重的经济影响[6,7]。疫苗预防接种是控制ND的重要措施,研制新型的基因工程疫苗是ND疫苗研究的重要方向。 HN蛋白作为重要的保护性免疫原之一,其诱导的单克隆抗体具有中和病毒感染的作用[8]。
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