IL-32

IL-32 篇1

1 资料与方法

1.1 一般资料

所有研究对象均来自2010年4月-2013年5月遵义医学院第五附属 (珠海) 医院骨科骨关节炎患者。试验组膝关节KOA患者62例中, 男33例, 女29例, 患者年龄50~82岁, 平均年龄77岁。对照组为该院健康体检者31例, 无KOA病史, 双膝关节X线平片正常, 行关节穿刺前与其签署知情同意书, 其中男17例, 女14例, 年龄24~52岁, 平均年龄44岁。

1.2 试验标本

两组滑液均在行膝关节腔穿刺时留取, 其中KOA试验组患者62例, 对照组31例。留取的标本均1500r/min离心10 min取上清, 置于-20℃冰箱保存备用。

1.3 材料和方法

1.3.1 主要仪器

普通冰箱, DK-600S电热恒温水槽 (上海白典仪器) , MK-3全自动酶标分析仪 (上海益联) 。

1.3.2主要试剂

IL-32 Antibody (N-20) (货号:sc-49999, 公司:Santa Cruz Biotechnology) ;IL-18 Antibody (C-18) AC (货号:sc-6177 AC, 公司:Santa Cruz Biotechnology) 。

1.3.3 方法

标本采取的标准为:试验组患者经临床症状及影像学检查, 显示符合KOA临床诊断标准, 参考2010年中华医学会风湿病学分会制定的《骨关节炎诊断及治疗指南》及X线诊断标准 (参考KellgrenLawrence分级标准[4]) ;正常对照组人员无临床症状及影像学检查阴性;关节滑液中IL-32和IL-18的测定采用酶联免疫法 (ELISA) :96孔板第一排的8个孔作为标准孔, 按以下浓度:1、5、10、20、30、40、50μL滴入各标准孔, 按50μL/孔稀释, 第一排的最后一个孔滴入超纯水作为空白对照, 利用标准孔数据在Excel下建立标准曲线。将制备的关节液恢复常温后, 各样品50μL加入其余样品孔, 在37℃的恒温箱中反应90 min;预先制备的0.01 mol/L的PBS液洗板3次, 滤纸印干;加入一抗 (IL-32、IL-18) 100μL, 37℃恒温箱中反应60 min;0.01 mol/L的PBS液再次洗板3次, 每次浸泡4 min, 滤纸印干;加入酶标液100μL, 37℃恒温箱中反应30 min;0.01 mol/L的PBS液洗板4次, 每次浸泡3 min, 滤纸印干;加入底物TMB 90μL, 置恒温箱中37℃在暗处反应11 min;每孔加入1滴终止液混匀, 当蓝色转为黄色时上机检测;DG5033A酶标仪设定450 nm处测定吸光值。

1.4 统计学方法

所有数据均输入计算机, 用SPSS 16.0版本软件进行统计学处理。计量资料以±s表示, 以P<0.05为差异有统计学意义。两个指标的试验组与对照组组间比较用单因素方差分析;作IL-32和IL-18的Spearman相关分析, 检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 IL-32和IL-18两个指标的试验组与对照组组间比较用单因素方差分析

IL-32和IL-18两个指标的试验组与对照组组间比较作单因素方差分析, 见附表。IL-32和IL-18两个指标的试验组与对照组比较差异有统计学意义 (P=0.023) , 表示CCl5、IL-8和NO 3个指标在骨关节炎关节滑液中表达与正常人比较异常增高。

注:*与对照组比较P<0.05

2.2 IL-32和IL-18的相关分析。

IL-32和IL-18表达水平作Spearman相关分析, 相关系数为γ=0.908 (P=0.001) , 两者呈正相关。

3 讨论

维持关节软骨及软骨下骨良好的生理功能, 是避免发生骨关节炎的重要保证[5]。目前KOA的发病机制尚未完全明确, 其中已明确了关节软骨及软骨下骨的病理改变为发病的根本, 局部的非感染性炎症改变是重要的病理生理变化[6]。炎症因子在膝骨关节炎的病理过程中是主要的影响因素之一, 有研究表明炎症因子是骨关节炎软骨组织被降解、破坏的主要介质, 不仅抑制软骨组织的合成, 还破坏及分解软骨组织[7]。IL-32作为新近发现的炎症因子在KOA的发病过程中是否高表达?IL-32与经典的炎症因子IL-18在KOA的发病过程中是否存在相关性?本文将对以上两个问题展开讨论。

IL-32是新近发现的促炎症细胞因子, 已有报道显示, 在类风湿关节炎及自身免疫性疾病上, IL-32高表达[8]。IL-32是通过激活NF-KB、P38/MAPK等信号转导通道, 从而使得免疫细胞分泌IL-6、IL-18、IL-1β及TNF-α等表达增高, 产生炎症反应[9]。但IL-32是否在骨关节炎关节滑液中高表达, 目前尚未有明确的报道。本研究发现IL-32在骨关节炎患者的关节滑液中表达量是正常人的2倍 (P<0.05) , 提示IL-32在骨关节炎患者的关节滑液中高表达, 这可能说明骨关节炎的局部炎症可能与IL-32相关。

IL-18是1995年才被发现的一种被多种细胞分泌的细胞因子, 其不但是经典炎症因子, 还是IFN-γ的诱导因子, 是一种炎症前期的多效能炎症细胞因子[10]。本研究发现骨关节炎患者的关节液中IL-18较正常对照组高表达, 与IL-32呈正相关, 由此表明, IL-32和IL-18在骨关节炎的发病过程中可能呈正相关。综上所述, 骨关节炎的发病过程中可能与IL-3密切相关, IL-32和IL-18在其中呈正相关关系。

参考文献

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IL-32 篇2

[关键词] URSA；干扰素-γ；白介素-32；白细胞介素-1β

[中图分类号] R741.21[文献标识码] B[文章编号] 1673-9701（2012）10-0082-02

Clinical significance of IFN-γ、IL-32、IL-1β in unexplained recurrent spontaneous abortion

SUN Congcong LIANG Yujie CHEN Qian ZHU Dan ZHU Yanle ZHENG Keqiong YAN Luoyuan

Department of Gynaecology and Obstetrics，the Affiliated Yueqing Hospital of Wenzhou Medical College，Yueqing 325600， China

[Abstract] Objective To explore the expression and the clinical significance of IFN-γ，IL-32 and IL-1β in Unexplained recurrent spontaneous abortion. Methods In method of ELISA to detect the serum level of IFN-γ， IL-32 and IL-1β in healthy control group， URSA group， pathological pregnancy group. Results The serum level of IFN-γ，IL-32 and IL-1β in URSA group are significantly increased as compared with healthy control group and pathological pregnancy group(P ＜0.01). The serum level of IFN-γ、IL-32 and IL-1β are significantly lower in pathological pregnancy group than in the healthy control group (P ＜ 0.05). Conclusion The IFN-γ，IL-32，IL-1βfeedback loop maybe involved in Unexplained recurrent spontaneous abortion.

[Key words] Unexplained recurrent spontaneous abortion (URSA); IFN-γ; IL-32; IL-1β

原因不明复发性流产（uｎｅｘplained recurrent spontaneous abortion， URSA）是指与同一性伴侣连续发生3次或3次以上自然流产，且不存在染色体、解剖、内分泌和自身免疫功能异常以及生殖道感染等病因。生殖免疫学观点认为，正常妊娠的维持有赖于妊娠妇女对胚胎半同种抗原的免疫耐受，一旦这种母胎免疫耐受被打破，将导致流产的发生。正常妊娠过程中，Th1/Th2型细胞因子保持一定的平衡，其中Th2型细胞因子占优势[1]，母体内IFN-γ-IL-32-IL-1β正反馈环路应受到抑制，可确保母婴免疫耐受。一旦此正反馈环失去控制，无限放大Th1模式，最终可能导致URSA的发生[2]。本研究通过检测IFN-γ、IL-32和IL-1β在原因不明习惯性流产中的血清浓度水平，以探讨IFN-γ、IL-32、IL-1β反馈环在原因不明习惯性流产中的作用。

1 资料与方法

1.1 研究对象

URSA组60例，均为本院妇产科门诊患者，所有病例均经过详细询问病史及体格检查，同时具备以下条件：①连续发生 3 次或 3 次以上原发性早期自然流产（３~６次），最后一次发生在 1 年以内；②夫妇双方染色体检查正常；③女方生殖道检查无解剖学畸形；④生殖内分泌激素水平测定及诊断性刮宫检查排除内分泌因素；⑤对宫颈分泌物进行PCR 检查排除生殖系统感染；⑥抗磷脂抗体等自身免疫性抗体检查结果显示阴性；⑦未进行过主动免疫治疗；⑧男方精液行常规检查结果显示正常。正常妊娠组30例，为同期妊娠 12周以内的正常妊娠女性，年龄 21～30岁，平均（25.40±2.95）岁，无自然流产史、无死胎死产史，无合并感染及自身免疫性疾病。本次妊娠期间无阴道流血及下腹疼痛等先兆流产的症状和体征；B 超显示胚胎发育正常。正常非孕妇女组（对照组）22例，为同期健康已正常生育妇女，既往无不良孕产史，有一胎及以上正常足月分娩史，年龄25 ~ 35岁，平均（２９．１２±２．３２）岁。对三组对象的一般资料进行比较，差异均无统计学意义（P ＞ 0.05）。

1.2 血清IL-32、IFN-γ和IL-1β测定方法

三组对象均空腹采集外周静脉自凝血5 mL，血液凝固后3 000 r/min离心5 min，分离血清置Eppendorf管中，-20℃冻存备测。采用ELISA法检测血清中IFN-γ、IL-32、IL-1β的水平。IL-1β ELISA试剂盒由北京博奥森生物技术有限公司提供，产品货号H1025；IFN-γ ELISA试剂盒由上海亨代劳商贸有限公司提供，产品货号Y10033A；IL-32 ELISA试剂盒由上海亚培生物科技有限公司提供，产品编号E1802h。严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.3 统计学处理

所有数据采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析。实验数据用均数±标准差（x±s）表示，各组间不同指标间差异采用单因素方差分析，两两比较，方差齐时采用LSD法，不齐时采用Dunnett's T3法。

2 结果

将三组研究对象血清IFN-γ、IL-32、IL-1β的浓度进行比较可以看出：①IFN-γ浓度：URSA组血清水平比正常妊娠组和对照组均显著提高，正常妊娠组比对照组显著下降；②IL-32：URSA组血清水平比正常妊娠组和对照组亦均显著提高，正常妊娠组比对照组显著下降；③IL-1β：URSA组血清水平比正常妊娠组和对照组亦均显著提高，正常妊娠组比对照组显著下降。

3 讨论

在生理妊娠过程中，母体和胚胎间免疫双向调节维持在一个动态平衡水平是妊娠成功的关键。怀孕期间母体内存在着复杂的免疫调节机制，主要表现为免疫耐受或免疫抑制增强，而免疫排斥减弱，一旦这种平衡状态被打破，就会导致病理性妊娠，甚至发生流产[3]。

正常妊娠表现为一种特殊的Th2现象，Th1处于抑制状态，各种 Th1型的细胞因子表达水平降低甚至消失，Thl/Th2 间的平衡始终保持在最有利于维持妊娠的向 Th2 型细胞因子的偏移。Th1 细胞主要分泌 IL-2、IFN-γ 和 TNF-β 等，参与细胞免疫、迟发型超敏反应和急性移植排斥反应，具有抗胞内病原体感染、抗病毒、抗肿瘤及妊娠中免疫排斥作用；而 Th2 细胞分泌 IL-4、IL-5、IL-6 和 IL-10 等，主要功能是介导体液免疫，刺激 B 细胞增殖并产生抗体，对同种移植产生免疫耐受。因此当Th1型细胞因子过度表达时，将导致反复自然流产（URSA）的发生[4-6]。IFN-γ是由Thl细胞所分泌的特征性细胞因子，能激活T细胞和吞噬细胞，而被激活的T细胞和吞噬细胞能够转录合成IL-32； IL-32通过活化NF-κB和p38 MAPK途径刺激T细胞和吞噬细胞释放IL-1β；IL-1β又可以正反馈作用于T细胞和吞噬细胞等，使之表达的IFN-γ受体明显增多，引发更多的IFN-γ活化[7]，形成了IFN-γ-IL-32-IL-1β正反馈环路，以T细胞和吞噬细胞为中心，不断放大Th1炎症免疫模式。

从本实验的研究结果可以看出IFN-γ、IL-32和IL-1β三种细胞因子在三组实验对象血清中的浓度变化表现出一致性。通过本结果我们可以作如下分析和推断：①反复发生自然流产的患者IFN-γ、IL-32、IL-1β的血清浓度明显升高，反映出IFN-γ-IL-32-IL-1β正反馈环路失去控制，IFN-γ受体越来越多，呈现出过度活化状态。IFN-γ是 Th1细胞因子，促进 Th1 细胞并抑制 Th2 型细胞的分化及分泌功能，降低 IL-4、IL-10的活性。这样，不明原因自然流产患者体内Thl/Th2的平衡状态被打破，从而导致了流产的发生。②正常妊娠组IFN-γ浓度比对照组显著下降，表明Th1处于抑制状态，使Thl/Th2 间的平衡始终保持在最有利于维持妊娠的 Th2 型细胞因子偏移。至此我们认为以T淋巴细胞亚群为中心，IFN-γ-IL-32-IL-1β正反馈环路失去控制，导致了Th1 细胞的过度表达，同时也可能抑制了Th2 型细胞的分化及分泌功能（有待进一步的研究证实），也就是说IFN-γ-IL-32-IL-1β正反馈环路失去控制是打破Thl/Th2的平衡状态的因素之一，从而引起了URSA疾病的发生。③在正常妊娠组IL-32和IL-1β的血清浓度比正常对照组显著下降。可能是因为 IL-32主要由 IFN-γ诱导产生且IL-32 mRNA在免疫组织中的表达高于其它组织中的表达[8]。而IL-1β浓度的下降可能与IL-32浓度的下降有关，因为IL-32能通过活化NF-κB和p38 MAPK途径刺激T细胞和吞噬细胞释放IL-1β[7]。但是IL-32和IL-1β除了在IFN-γ-IL-32-IL-1β正反馈环路中对Thl/Th2平衡起作用，其血清浓度的变化对生理性妊娠过程是否存在影响尚有待进一步的研究得出结论。通过本试验我们可以得出结论——对IFN-γ、IL-32、IL-1β血清浓度的检测不仅可作为监测URSA患者治疗效果和再次妊娠结局的指标，也为进一步研究URSA的治疗方法和发病机制提供了新思路。而这些指标参与URSA发生的具体机制还有待更加深入地研究。

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（收稿日期：2011-12-09）