抗菌药物敏感性试验 篇1
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌株来源
兰州大学第一医院2008年1月～2008年12月期间各临床科室送检的细菌培养标本, 包括痰、鼻咽拭子、血、脑脊液等共分离出流感嗜血杆菌182例。
1.1.2 培养基
巧克力培养基以英国Oxoid公司的Columbia琼脂为基础培养基, 加入5%的脱纤维绵羊血, 80℃水浴15min溶血, 50℃左右时加入250g/ml的万古霉素和75g/ml的辅酶I, 倾注平板。药敏试验用HTM培养基为英国OXOID公司产品。
1.1.3 药敏纸片
复方新诺明、氨苄西林、左氟沙星、阿齐霉素、头孢呋辛、氨苄西林/舒巴坦、氨曲南和美洛培南药敏纸片均为英国OXOID公司产品。
1.1.4 头孢硝噻吩滤纸片
美国BBL公司产品
1.2 方法
1.2.1 菌株分离与鉴定
标本分别接种于羊血平板和流感嗜血杆菌选择性巧克力平板上, 放35℃, 5 %～10%CO2培养箱中18～24h后, 挑取血平板上不生长、巧克力平板上生长的无色或灰白色、透明或半透明、圆形、光滑的菌落作革兰氏染色, 镜检为革兰氏阴性短小杆菌, 形态多样。然后将该菌与金黄色葡萄球菌ATCC 25923共同接种于血平板上和普通营养琼脂平板, 观察卫星现象, 血平板卫星现象阳性, 普通营养琼脂平板卫星现象阴性者判为流感嗜血杆菌[2]。
1.2.2 药敏试验
采用K-B法。以Haemophilus test medium (HTM) 琼脂为培养基, 参照美国临床实验室标准化委员会 (NCCLS) 制订标准 (2001年版) 判断结果。
1.2.3 β-内酰胺酶实验
采用头孢硝噻吩滤纸片法, 被检菌用接种环置于头孢硝噻吩滤纸片上, 于10min内由黄色变为红色者为阳性, 反之为阴性。
1.2.4 药敏质控
全部实验过程用流感嗜血杆菌质控菌株ATCC49247做质控, 结果符合要求。
2 结果
2.1 β- 内酰胺酶检测结果
在所分离出的182株流感嗜血杆菌中, 产β-内酰胺酶43株, 产酶率23.6%。
2.2 8种抗菌药物对流感嗜血杆菌的药敏结果见表1
3 讨论
1) 流感嗜血杆菌自身缺乏某些酶类 (生长因子) , 人工培养时需要X因子和V因子才能生长, 故一般临床实验室分离率不高。本实验所用的流感嗜血杆菌选择性巧克力平板, 营养高、且抑制革兰阳性杂菌生长, 选择性强, 流感嗜血杆菌菌落清晰、易辨, 适于流感嗜血杆菌的分离培养。
2) 文献报道流感嗜血杆菌产生β-内酰胺酶率在2.6 %～45%之间不等[3,4], 本报道中182例流感嗜血杆菌中产酶率为23.6% , 与国内报道相一致。
3) 各地医生的经验用药习惯及抗菌药物应用频度不同, 了解本地区目前的流感嗜血杆菌的药敏情况, 对于控制感染及降低盲目经验性用药导致的选择性耐药菌株增多具有重要意义。由表1可知, 流感嗜血杆菌对氨苄西林的敏感率为51% , 而对氨苄西林/舒巴坦的敏感率为82% , 说明流感嗜血杆菌耐药机制主要是由于产生β-内酰胺酶, 水解了氨苄西林分子结构上的β-内酰胺环, 使氨苄西林失去活性而耐药。流感嗜血杆菌对复方新诺明敏感率仅为41% , 说明磺胺类药物已不再适用于临床治疗流感嗜血杆菌所致的感染。对头孢呋辛、氨苄西林/舒巴坦、氨曲南和美洛培南的敏感率均在70%以上, 对流感嗜血杆菌具有较高的抗菌活性, 临床医师可选择这些药物治疗流感嗜血杆菌所致感染。
参考文献
[1]张泓, 昊文娟, 李万华, 等.流感嗜血杆菌氨苄西林耐药基因研究[J].中国感染与化疗, 2006 (12) :377-379.
[2]王羽.中华人民共和国卫生部医政司.全国临床检验操作规程 (第3版) [M].南京:东南大学出版, 2006:836-837.
[3]刘文昭, 刘兴志, 陈彗莉, 等.流感嗜血杆菌耐药检测[J].华西医学, 1999 (14) :16-148.
抗菌药物敏感性试验 篇2
1 材料与方法
1.1 菌株来源
检测菌株均由国家参比室提供, 由湖北省参比实验室转种后下发给本室培养, 第31株为标准结核分枝杆菌H37Rv敏感株, 用以检测含药培养基质量。
1.2 药敏培养基的制备
按湖北省参比实验室的统一要求配制。含药培养基分别为INH/RFP/SM/EMB, 阳性对照培养基为改良罗氏培养基。对照培养基及含药培养基配制方法均按照WHO《结核病控制实验室工作手册 (1998) 》中的有关规定执行[1]。2～8℃贮存, 3个月内使用。
1.3 实验操作
用间接比例法, 每份标本及每种药均接种两支菌量分别为10-2、10-4CFU/管[2]。2009年31株菌株分别于7月14日 (10株) 、19日 (7株) 、27日 (12株) 、31日 (2株) 四次接种, 分别放置于36.5℃两个培养箱内, 其中在14、19、31日接种的19株菌株的培养箱温控器于8月1日18点以后突然失灵, 8月2日上午8时笔者观察时箱内温度显示45℃, 维持时间小于14h, 续将这19株菌株转移至36.5℃培养箱中继续培养, 至4周观察结果。2010年31株菌株, 一次性接种放置于36.5℃培养至4周观察结果。
2 结果
2.1 阳性对照生长情况
2009年31株标本中, 由于有19株标本受温控器失灵导致的短期温度升高的影响, 因而各时间段接种的标本阳性对照的生长情况有一定差异: 7月7日接种的12株 (每株2管, 以下同) 阳性对照中有23管生长良好, 其中一株-2浓度未生长, 但-4浓度1+;温控器失灵的培养箱内的19株标本中, 7月14日接种的10株标本, 阳性对照生长的有8株计14管, 两株-4浓度对照管未生长;19日接种的7株标本中阳性对照生长的有2株 (其中一株为 H37Rv敏感株) 中的-2浓度管, 但只有几个菌落, -4浓度管无菌落生长, 31日的2例阳性对照无一生长。2010年的31株标本, 阳性对照中有58管生长良好, 一株-2浓度管未生长, 但-4浓度管2+, 3株-4浓度管未生长, H37Rv敏感株阳性对照生长良好;两种浓度阳性对照菌落生长融合未显出明显浓度差异3例。
2.2 污染情况
2009年检测的标本中-2浓度管全部污染1例;2010年检测的无污染。
2.3 计算耐药百分比
若耐药百分比>1%则认为受试菌对该抗结核药耐药, ≤1%则为敏感[2]。本文主要统计与国家参比室结果的符合率。由于2009年的31株标本阳性对照生长的只有22株, 因此其药敏结果的比较只能以22株来计算, 与国家参比室的结果相比符合株数比依次为INH 18/22、 RFP 17/22、SM 4/22、EMB 5/22;2010年 INH29/31、 RFP 28/31、SM 26/31、EMB 25/31。
3 讨论
3.1 部分阳性对照未长 (1) 温度的影响。从以上结果观察中可看出:在结核杆菌培养过程中, 相对短期的45℃环境, 对经36.5℃环境培养时间在2周以内的9株标本影响极大, 阳性对照生长率为2/18, 但对36.5℃环境培养时间超过2周的标本影响相对较小, 阳性对照生长株数比为16/20。这可能因为结核分枝杆菌是慢生长菌, 代期较长;此外细菌的初期生长有其一定的生长调整周期, 这一时期内受环境温度影响较大。以后细菌进入对数生长期, 短期的温度略升, 对细菌的生长繁殖影响相对较小。 (2) 菌落未磨匀、稀释不均匀、接种环挑取了空泡等也是造成部分对照不生长的主要原因。
3.2 未显出明显浓度差异 配制1mg/ml浓度菌液时菌量过多, 两浓度阳性对照培养基的生长程度均在3+～4+。
3.3 污染 -2浓度全污染1例, 且菌落生长特征相同, 经革兰氏染色证实为真菌污染。本例低浓度培养管未见污染, 接种环境污染应可排除, 可能首先接种的阳性对照培养基在贮存过程中被污染但未被发现, 后仍经依次接种导致本例整个-2浓度培养基被污染。
3.4 结果观察与判断的难点 通过这两次测试, 结合平时的实验观察, 发现: (1) 少数菌株无论是在阳性对照还是含药培养基上在四周的报告期限内菌落生长不明显, 延迟1～2周可获明显结果。此类菌株生长速度更为缓慢, 但延长时间观察是否会影响结果的准确性却值得探讨。 (2) 绝大多数耐药菌株耐药百分比均较大, 但偶有临床提示疗效欠佳 (治疗3个月末仍菌阳) 而药物敏感实验结果显示利福平0<耐药百分比≤1%的病例, 重复实验结果仍然相同。此类标本用绝对浓度法检测是否为RFP低浓度耐药, 高浓度敏感尚不得而知。但有文献报道, 比例法和绝对浓度法在检测结核分枝杆菌对1NH、RFP和EMB的药物敏感性时差异有统计学意义[3]。
3.5 2009年阳性对照生长良好的20株标本SM、EMB全部耐药, 与国家参比室的结果相比符合株数比却分别只有4/22, 5/22。因同批H37Rv敏感株受温度影响较大, 其结果不能作为评价含药培养基质量的依据, 结合同时参加这两次试验的其他实验室的结果, 推测可能为含药培养基的配制问题。
3.6 SM、EMB与国家参比室的结果相比仍未达到符合率90%的要求, 其原因仍有待分析。
4 对策
根据参加结核杆菌药物敏感性试验室间质评结合本室平时结核杆菌培养和药物敏感性试验的经验, 笔者认为提高结核杆菌药物敏感性试验准确率要注重做好下列工作。
4.1 培养基的配制及保存
培养基的配制主要注意各药物的质量、称量的准确性、稀释比例的正确与否及灭菌的温度和时间等;培养基应在2～8℃低温保存且不超过3个月, 不得暴露在紫外线下。
4.2 实验过程的规范化
(1) 做好实验室环境及实验器材的消毒灭菌工作。 (2) 防范交叉污染。批量测试时在磨菌、稀释及接种过程中均有产生交叉污染的可能。特别是要防范粘有菌液的塑料接种环弹出试管外引起交叉污染和环境污染。 (3) 1mg/ml菌液的配制:首先挑取尽可能大范围的菌落, 以防漏掉可能的变异株;其次挑取菌落时不得杂有培养基, 菌落要尽可能磨匀, 并取适量生理盐水冲洗磨菌棒及管壁后混匀放置, 待未磨匀的粗大颗粒沉淀后取液体上部混悬液稀释比浊, 稀释管与标准比浊管材质及大小要尽可能一致, 便于肉眼比浊。 (4) 接种菌液前先观察培养基是否新鲜, 有无污染, 稀释与接种时均要注意稀释是否均匀, 挑取菌液是否足量, 有没有挑空环或气泡。用划线法接种注意尽可能使菌液均匀分散于培养基斜面。
4.3 每天作好培养环境温度的监测
将培养箱的温度控制在 (36.5±1) ℃。结核分枝杆菌复合群的最适生长温度为35～37℃, 而有些类型的分枝杆菌在25℃、30～33℃或45℃也可生长[4]。
4.4 结果观察时两浓度阳性对照管应显示明显的浓度梯度, 以此作为判断菌液稀释比例正确与否
在观察结果时, 无论是在这两批次的测试中, 还是在日常的药敏检测中也常见菌株生长速度不一的现象。有的菌株生长快速, 在1周内生长的多为非典型分枝杆菌, 在PNB培养基中可生长, 据此可与结核分枝杆菌复合群相鉴别[5], 2008-2010年本室检测出非典型分枝杆菌7例, 其中痰标本5例, 尿标本2例, 菌落初次生长时间均小于7d。
摘要：目的:探讨间接比例法检测结核杆菌药物敏感性试验的影响因素。方法:通过对我室2009、2010年两次参加国家结核病参比室组织的结核杆菌药物敏感试验室间质评的结果进行比较与分析, 找出影响实验成败的关键因素包括含药培养基配制的质量控制、实验过程的规范化、环境温度的实时监测、结果观察及判断等等, 为以后的实验提供技术支持。结果:2010年与国家结核病参比室的药敏结果符合率比2009年有较大的提高。结论:培养基的质量、培养的温度和操作人员的技术娴熟程度均会影响药敏试验结果。
关键词：间接比例法,结核杆菌,药物敏感试验,影响因素
参考文献
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[2]王陇德, 刘剑君, 姜世闻.结核病防治 (M) .北京:中国协和医科大学出版社, 2004:108-109.
[3]武杰, 桂晓红, 等.比例法与绝对浓度法检测结核分枝杆菌药敏试验的比较 (J) .中华检验医学杂志, 2011, 34:137-138.
[4]谢惠安, 阳国太, 等.现代结核病学 (M) .北京:人民卫生出版社, 2000:99-103.
抗菌药物敏感性试验 篇3
北京药学会抗生素专业委员会
“头孢类抗菌药物皮肤过敏试验高端论坛”会议于2008年6月2日在北京举行。中国药品生物制品检定所常务副所长金少鸿教授、抗生素室主任胡昌勤教授、解放军302医院感染科姜素椿教授、北京协和医院药剂科李大魁教授、中国医学科学院医药生物技术研究所副所长邵荣光教授、蔡年生教授、北京药学会冯国安理事长、国家食品药品监督管理局药品评审中心张哲峰教授、北京海军总医院孙忠实教授、空军总医院李忠东教授、首都医科大学附属北京天坛医院赵志刚教授等参加了此次论坛。金少鸿、胡昌勤、李忠东、赵志刚分别就头孢类抗菌药物的质量与过敏反应的关系、头孢类抗菌药物过敏反应研究进展、国外头孢类抗菌药物皮肤过敏试验情况介绍、全国部分地区医疗机构头孢类抗菌药物皮肤过敏试验调查报告做了学术报告。与会专家、学者针对学术报告和实际工作中存在的问题进行了充分的讨论，并在以下几方面达成了共识。使用青霉素类抗菌药物必须进行皮肤过敏试验。原因是过敏反应的抗原一主要决定簇一青霉噻唑决定簇与次要决定簇一青霉烯酸决定簇已非常明确。皮试符合率可达70％ ；皮试液的浓度与皮试方法均已规范。头孢类抗菌药物使用前是否需要进行皮肤过敏试验尚存在争议。原因在于引发头孢类抗菌药物过敏反应的半抗原一主要决定簇与次要决定簇尚不明确，可能有Cephalosporoyl、Cephalosporanyl和
产品中的杂质等；皮试符合率<30％ ；皮试液浓度与皮试方法未统一(国内皮试液和国外皮试液的种类、浓度和皮试液用量相差很大)。目前美国和大部分欧洲国家不进行皮肤过敏试验，而日本和北欧的一些国家仍规定进行皮肤过敏试验。头孢类抗菌药物是否需要做皮肤过敏试验，在我国药品说明书和参考书中现有多种描述，但中华人民共和国药典委员会编写的《临床用药须知》(2005年版)和卫生部2004年发布的《抗菌药物临床应用指导原则》均未要求头孢类抗菌药物做皮肤过敏试验。本次论坛达成的共识是：如果药品说明书明文规定使用前需做皮肤过敏试验则必须做；如果药品说明书上未明确规定，则需根据患者是否为过敏体质、既往药物过敏史、患者的患病严重程度等综合考虑是否进行皮肤过敏试验。如果进行头孢类抗菌药物的皮肤过敏试验；必须使用原药配制皮试液，不能用青霉素皮试液代替，也不能用某一种头孢菌素配制成皮试液做所有头孢类抗菌药物的皮肤过敏试验。皮试液的浓度国、内外的差距较大，国内目前推荐的浓度为300～500 g〃mL，注射量为0．1mL。如果患者对青霉素类严重过敏，应禁用头孢类抗菌药物；如果患者对青霉素类一般过敏，可根据病情慎重地选用头孢类抗菌药物，现有的研究表明，青霉素类与一代头孢的交叉过敏反应发生率明显高于二代、三代和四代，因此，宜选用二、三、四代头孢，特别三、四代头孢更为安全。头孢类抗菌药物的产品质量与临床上发生的过敏反应有相关
性。现已从头孢噻肟等头孢类抗菌药物中收集到了能引发动物过敏反应的基本无抗菌活性的高分子聚合物。说明控制产品中高聚物的含量是质量控制的关键之一。临床使用头孢类抗菌药物，必须仔细询问病人药物过敏史，不管是否进行皮肤过敏试验，或皮肤过敏试验阴性，在首次使用后的0．5～1h内应严密观察，一旦出现过敏反应征兆，应迅速处理。过敏反应是难以预测的，过敏反应的发生不是医务人员的责任，但发生后处理不当或没有相应的救治措施，医院则要面临一定的法律风险。
本次论坛上，与会专家学者也提出一些希望和建议，提请国家相关部门考虑，尽快落实，以保障我国广大患者的医疗安全。
l 鉴于头孢类抗菌药物中相关杂质与过敏反应有高度相关性，国家应加强相关工作的研究，提高产品的质量标准，以减少过敏反应的发生。国家应规范头孢类抗菌药物的说明书，现有的说明书上标明为“以进行皮肤过敏试验为宜” 等术语对临床来说难以理解和把握，也容易造成不必要的纠纷；同时，同一通用名的头孢类抗菌药物，有的有“以进行皮肤过敏试验为宜” 这句话，有的没有，造成临床混乱。我们的调查报告表明，目前我国大多数医院使用头孢类抗菌药物均做皮肤过敏试验，但使用的皮试液种类、浓度、用量、配制和贮存方法等都存在差异，皮试的阳性率差异很大(10％ ～50％)，极需要规范和培训，以减少不必要的浪费和错失最佳治疗方案和时机。中国是抗菌药物使用大国，有丰富的研究样本，建议国家组织相关专家进行大样本研究，评价头孢类抗菌药物皮肤过敏试验的利与弊、得与失，从而最终明确头孢类抗菌药物是否需要进行皮肤过敏试验。