抑制基因蛋白十篇

抑制基因蛋白 篇1

关键词：丝氨酸蛋白酶抑制因子,Hespintor,逆转录PCR,基因克隆,生物信息学

0 引言

Hespintor是利用抑制性差减扣除杂交技术研究乙型肝炎病毒DNA聚合酶反式调节作用,从人肝母细胞瘤HepG2细胞中筛选得到的一未知功能新基因,经Real Time PCR验证后,结合生物信息学方法确定该基因是一种新的Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子(serine proteinase inhibitor,SERPIN),具有自主知识产权。氨基酸序列同源分析表明,Hespintor具有与食管癌相关基因2(esophageal cancer related gene 2,ECRG2)高度同源的serpin基本结构[1]。由于ECRG2具有抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭及转移等作用,因此提示Hespintor可能也具有同样的抗肿瘤能力[2,3]。至今尚未见国内外文献报道该基因。为了进一步研究并阐明Hespintor的生物学功能,我们拟克隆得到Hespintor基因,并对其进行序列分析。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

大肠埃希菌JM109和人肝母细胞瘤细胞系HepG2均为作者实验室保存。

1.1.2 试剂

RNAiso Plus、TaKaRa RNA LA PCR Kit、TaKaRa PCR Fragment Recovery Kit、TaKaRa DNA Ligation Kit、DNA Marker DL2000和pMD 20-T Vector均购自宝生物工程(大连)有限公司,其它试剂均为国产分析纯。根据NCBI已注册的Hespintor基因序列(GenBank Accession:DQ438947),设计PCR正向引物:5’-ATGGCTGCCTTTCCCCACAA-3’;PCR反向引物:5’-GCCGGTTAATCACATTTTCCATA-3’。引物合成和DNA测序由宝生物工程(大连)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR获得Hespintor cDNA

利用RNAiso Plus从HepG2细胞中提取总RNA,进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。以HepG2细胞总RNA为模板,利用TaKaRa RNA LA PCR Kit,先逆转录合成cDNA,再以cDNA为模板,PCR扩增Hespintor基因片段。PCR反应条件:94℃ 2min;94℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 1min,30 Cycle;72℃ 10min。PCR反应结束后,进行2%琼脂糖凝胶电泳。利用TaKaRa PCR Fragment Recovery Kit切胶回收Hespintor基因片段,并将其溶解于无菌ddH2O中。

1.2.2 构建Hespintor克隆质粒

利用TaKaRa DNA Ligation Kit中的SolutionⅠ,将回收的Hespintor基因片段与pMD 20-T Vector连接过夜后,转化至JM109感受态细胞中,涂布LB/Amp/X-Gal/IPTG筛选平板,37℃培养过夜。挑取阳性菌落进行菌落PCR鉴定,并提取重组质粒进行DNA测序。

1.2.3 Hespintor序列分析

利用在线工具软件SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)对Hespintor进行信号肽预测;PSORTⅡ(http://psort.hgc.jp)进行亚细胞定位分析;Motif Scan(http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan)进行结构域分析;SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org)进行三级结构预测。登录NCBI UniGene数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/unigene)对Hespintor基因进行染色体定位及组织分布表达分析。

2 结果与分析

以HepG2细胞总RNA为模板,RT-PCR扩增获得了预期的285bp Hespintor基因片段,琼脂糖凝胶电泳结果见图1。连接至pMD 20-T克隆载体上的285bp的Hespintor基因片段,经通用引物M13 Primers进行菌落PCR扩增后,可产生441bp的扩增产物,2%琼脂糖凝胶电泳鉴定结果见图2。选择经菌落PCR扩增结果较好的阳性菌落,提取其重组质粒进行序列测定,测序结果符合预期的目的基因序列,结果见图3。

M:DNA Marker DL2000;1:Hespintor cDNA.

M:DNA Marker DL2000;1-7:PCR Product of positive colonies.

Motif Scan分析表明Hespintor有一个Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子结构域,位于35-93aa。该结构域一般由50～60个氨基酸残基组成,其中包括一个较为保守的序列模体和6个半胱氨酸残基:CⅠ—X(1-7)—CⅡ—X(5)—PVCⅢG—X(4)—TY—X—N—X—CⅣ—X(2-6)—CⅤ—X(9-17)—CⅥ(X与括号内的数字分别表示任意残基和残基的数目)。Hespintor在基本结构上缺失了第一个半胱氨酸残基,与其它Kazal家族成员既有相似性又有独特性,结果见图4。结合SignalP分析可知,Hespintor结构包括3部分:N端l-23aa编码信号肽,表明其具有分泌到细胞外的性质,并符合PSORTⅡ预测Hespintor亚细胞定位于细胞外的结果;C端35-94aa编码成熟肽,其中53-93aa编码一个典型的Kazal结构域;在信号肽与成熟肽之间的24-34aa即构成了连接区,结果见图5。SWISS-MODEL预测发现Hespintor结构主要由螺旋和折叠组成,结果见图6。

Hespintor基因的开放读码框架(ORF)长度为285 bp,编码产物由94aa组成。经Unigene数据库分析发现,Hespintor基因定位于人类5号染色体长臂3区3带1亚带(5q33.1);正常组织仅在睾丸中有表达,而肿瘤组织中仅生殖细胞瘤有表达。

3 讨论

传统抗肿瘤化学药物尽管在临床上已取得了广泛疗效,并在一定程度上可控制肿瘤发展,但其明显的毒副作用,尤其是耐药性的发生不容忽视。随着肿瘤发病分子机制的逐渐揭示,抗肿瘤药物治疗目标趋向高效、低毒、靶向和个体化,而基因工程药物具有对肿瘤杀伤作用大、毒副作用小、靶向性强的优点。

已有研究表明,肿瘤细胞产生的蛋白酶降解ECM及基膜的能力与其侵袭、转移能力密切相关。尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)是肿瘤细胞分泌的一种丝氨酶蛋白酶,可活化纤溶酶原成为纤溶酶,继而活化前基质金属蛋白酶成为基质金属蛋白酶(MMP);MMP通过降解ECM破坏肿瘤细胞侵袭、转移的组织学屏障。在此级联式反应中,uPA发挥着关键性作用,被认为是肿瘤局部浸润和/或形成远处转移的限速步骤。尽管可在多个层次上调控蛋白酶活性,但最直接的方法还是阻断蛋白酶活性[4,5]。因此,干预uPA水平或功能可成为治疗肿瘤的一种有效方法。

SERPIN是一类丝氨酸蛋白酶活性调节因子,参与血凝、纤维蛋白溶解、炎症和免疫反应、胚胎发生及个体发育过程。根据它们的序列特征和三维结构,目前归类为18个非同源蛋白质家族,其中以Kazal型SERPIN抑制uPA活性最为直接也最具有临床应用前景[6]。Kazal型SERPIN属于较为保守的家族之一,其成员多为小分子多肽,其中某些成员具有抑制肿瘤细胞增殖和侵袭的活性,从而成为肿瘤治疗的新靶点[7]。分析表明,正常组织中Hespintor基因只在睾丸有表达,而肿瘤组织中仅在生殖细胞瘤有表达[8],强烈提示Hespintor在机体内属于静止表达基因,其表达缺失可能造成肿瘤的侵袭转移。应用生物信息学方法对Hespintor基因进行分析具有重要的指导意义,为下一步的重组蛋白表达、纯化复性及活性研究奠定了坚实的基础。

参考文献

[1]迟庆,伦永志.Kazal型人类丝氨酸蛋白酶抑制因子研究现状[J].中华临床医师杂志:电子版,2010,4(8):117-118.Chi Qing,Lun Yong-Zhi.Research status of Kazal type human serine pro-teinase inhibitor[J].Chin J Clinicians(Electronic Edition),2010,4(8):117-118.

[2]Cui Y,Bi M,Su T,et al.Molecular cloning and characterization of anovel esophageal cancer related gene[J].Int J Oncol,2010,37(6):1521-1528.

[3]Cheng X,Shen Z,Yin L,et al.ECRG2 regulates cell migration/invasionthrough urokinase-type plasmin activator receptor(uPAR)/beta1 integrinpathway[J].J Biol Chem,2009,284(45):30897-30906.

[4]Fisher JF,Mobashery S.Mechanism-based profiling of MMPs[J].Methods Mol Biol,2010,622(1):471-487.

[5]Cheng X,Lu SH,Cui Y.ECRG2 regulates ECM degradation anduPAR/FPRL1 pathway contributing cell invasion/migration[J].CancerLett,2010,290(1):87-95.

[6]Olson ST,Gettins PG.Regulation of proteases by protein inhibitors ofthe serpin superfamily[J].Prog Mol Biol Transl Sci,2011,99(1):185-240.

[7]Pantoja-Uceda D,Arolas JL,Aviles FX,et al.Deciphering the struc-tural basis that guides the oxidative folding of leech-derived tryptase inhib-itor[J].J Biol Chem,2009,284(51):35612-35620.

抑制基因蛋白 篇2

来自四川大学生命科学学院, 霍德华休斯医学院, 凯斯西储大学 (case western reserve University) 等处的研究人员揭示了在人类结直肠肿瘤发生发展过程中的一个起着关键作用的信号传导通路, 这对于研究人类结直肠肿瘤的起源有着重要意义。

已有大量研究表明, 在人类结直肠肿瘤中最易发生突变的是蛋白酪氨酸磷酸酶受体T (PTPRT) , 然而受PTPRT调节的细胞信号途径并不清楚, 有待深入研究。 在这篇文章中, 研究人员证明了PTPRT的直接作用底物是Paxillin, PTPRT能特异性地调节Paxillin Y88的磷酸化程度。通过在人类结直肠肿瘤细胞中构建的Paxillin Y88F纯合子突变细胞系, 研究人员发现其细胞迁移和受损锚地非依赖性生长都有显著性降低。同时, 这些细胞不能在裸鼠体内形成移植瘤, 接头蛋白p130CAS、作为多种生长因子和细胞因子的下游信号分子蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2以及PI3K下游分子丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AKT的磷酸化水平也有所减少。 通过构建PTPRT基因敲除的小鼠, 研究人员发现在小鼠结肠中的Paxillin Y88磷酸化水平上升, 在氧化偶氮甲烷致癌剂诱导下该小鼠极易发生结肠肿瘤, 该结果首次在动物体内证明了PTPRT作为肿瘤抑制基因的功能。这些结果还显示, Paxillin Y88磷酸化的增加也是人类结直肠肿瘤中的一个共通现象。该研究结果揭示了在人类结直肠肿瘤发生发展过程中的一个起着关键作用的信号传导通路。

“Faculty of 1000 Biology”创办于2002年1月, 是一种在线科研评价系统, 其推荐原则立足于论文本身的科学意义而非发表在什么杂志上。该系统根据全球2300多名资深科学家的意见, 提供对近期发表的生物科学论文的快速评论, 目的是帮助广大科研人员遴选和发现有价值的研究工作。 点评该文章的是来自美国加利福利亚大学圣地亚哥分校的的Richard Klemke教授, 作为该校蛋白质组学生物标记和诊断开发中心和癌症影像网络中心主任, 他是"Faculty of 1000 Biology"专家成员之一, 主要从事病理学、细胞学和蛋白质组学方面的研究。

抑制消减杂交筛选乳腺癌相关基因 篇3

【摘要】目的：为了研究乳腺癌发生的分子遗传学机理，分离克隆模型鼠乳腺癌组织中特异表达的基因。方法：利用抑制消减杂交技术，结合反向cDNA斑点杂交试验，小鼠乳腺癌组织中分离出与正常乳腺组织差异表达的EST，应用生物信息学方法鉴定所得EST的小鼠同源基因，并分析其与乳腺癌发生的相关性。结果：获得20个在小鼠乳腺癌组织中高表达的，与已知的小鼠基因片段高度同源的基因，及2个与数据库中提交的假想蛋白基因高度同源的基因。结论：利用抑制消减杂交技术，可以高效高通量分析在乳腺癌中特异表达的基因，探讨乳腺癌发生的分子机制。

【关键词】抑制消减杂交技术；乳腺癌；基因

【中图分类号】R737.9【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2009)10-0021-02

Screening Specific Expressed Genes of Breast Cancer by SSH

WANG YanZGHONGShijunSHAO MinZHANG Qingfeng

(ZUNYi Medical College School of Zhu Hai ,GUANG Dong,Zhu Hai ,519041）

【Abstract】 Objective In order to study the molecular mechanism of breast cancer, to screen the genes differentially expressed in breast cancer. Methods Suppression subtractive hybridization (SSH)combine reverse dot blotting was performed to isolate the differentially expressed genes between breast cancer and normal mammarytissues. A subtractive cDNA library of highly expressed genes in breast tumor tissue was established. Result About 22 differentiallyexpressed genes were obtained. By sequencing and BLAST analysiswe found 2 genes are new genes. Conclusion SSHis an effective method with high specificity to detect specific expressed genes in breastcancer genesisanddevelopment.

【Keywords】SSH；breast cancer；gene

乳腺癌是一种女性多发的恶性肿瘤。我国原属乳腺癌低发区，但近年来也出现明显上升趋势。随着分子生物学的发展,对癌基因和抑癌基因研究的深入,他们已经成为新一代的肿瘤标志物^[1,2]。本文以抑制消减杂交技术（SSH），结合反向cDNA斑点杂交试验，从乳腺癌转基因模型小鼠乳腺癌组织和正常乳腺组织中筛选乳腺癌组织高表达基因^[3]。以期发现与乳腺癌发生发展相关基因和诊断标志物，为乳腺癌的防治研究奠定基础。

1材料和方法

1.1材料FVB/N-Tg (MMTVneu)202Mul/J转基因小鼠，购于美国The Jackson Laboratory。

1.2主要实验试剂PolyA Ttract mRNA Isolation Systems Kit购自Promega公司；PCR-Select cDNA Subtraction Kit购自Clontech公司；DIG-11-dUTP购于Roche公司。

1.3方法

1.3.1抑制消减杂交按PCR-Select cDNA Subtraction Kit说明书，以转基因小鼠乳腺癌组织作为检测子（tester），正常乳腺组织作为驱赶子（driver），各以2μgmRNA为模板，合成双链cDNA，经Rsa I酶消化，接头连接两轮杂交，两轮PCR，纯化第二轮PCR产物，得到消减产物。每一步都经过试验验证效率。

1.3.2反向cDNA斑点杂交纯化上述PCR产物，经NaOH变性后分两个阵列平行点样于两张尼龙膜上，每个点面积为0.5cm×0.5cm，点加浓缩的PCR产物约200ng (1μL)。经紫外交联固定。用DIG-11-dUTP标记探针，探针为tester和driver的cDNA。经过预杂交、封闭、洗膜等步骤，分别和两种探针共孵育，再进行洗膜、封闭、洗膜，经DAB暗室显色至满意程度。

1.3.3测序及同源性分析挑取经验证的阳性克隆，送Invitrogen公司测序，利用BLAST软件分析。

2结果

2.1总RNA的提取提取总RNA，其D260/D280均大于1.9，琼脂糖电泳可见清晰28s、18s条带（图1）。

2.2消减效率检验未消减对照中的看家基因G3PDH经18个循环扩增几出现扩增条带，而消减后在28个循环后扩增条带刚刚可见（图1），显示经过消减杂交及抑制性PCR，丰度相同的基因得到有效抑制。

2.3PCR检测阳性克隆消减产物经T/A克隆，蓝白斑实验随机筛选了258个阳性克隆，用巢氏PCR的内因物进行PCR检测，剔除无产物的克隆，选取扩增片段在200-1000bp之间，冗余性尽可能低的240个克隆进行进一步分析。部分PCR检测结果如下图（图2）。

2.4反向cDNA斑点杂交结果阳性克隆的PCR产物平行点在尼龙膜上，分别与地高辛标记的tester和driver cDNA探针进行杂交，结果提示多个克隆存在杂交信号的差异（图3）。

2.5序列测定和同源性分析挑取50个差异显示的阳性克隆质粒送去测序，用BLAST软件分析，在50个获得EST中，有27个分别与16个已知基因高度同源，2个EST与假想基因同源。筛选出的已知基因见表1。

3讨论

基因组中基因的选择性表达决定了生物体的各项生命活动。因此，了解疾病病理过程不同阶段基因表达差异，疾病过程与正常发育过程的基因表达差异，对于疾病的诊断与治疗具有重要意义。随着分离组织特异性基因的研究方法不断发展，人们对各种疾病的研究逐渐深入到分子水平。抑制消减杂交是Diatchenk等^[4]提出的较代表性差异分析法更简便而有效地寻找差异表达基因的方法，它是以抑制PCR为基础的cDNA消减杂交方法，它的特点是假阳性低、敏感性高，对于低丰度的差异表达基因也能有效的分离。本研究应用抑制消减杂交技术结合反向cDNA斑点杂交试验，获得的28个EST中，有27个与16个已知基因高度同源，从表1可以看出，在这些基因中，casein kappa (Csnk)是乳腺组织分化的标记物^[5]；casein gamma (Csng)能够被催乳素诱导，transferrin (Trf)有多篇文献报道其在乳腺癌等恶性肿瘤中表达增高、member RAS oncogene family (Rab25)属于RAS原癌基因家族，这些结果提示乳腺癌的发病与发展过程中涉及多个基因的差异表达。此外，在我们获得EST中还有一个假想基因，功能不明，在后面的工作中我将对这个EST进行重点研究。本文首次以小鼠乳腺癌组织为研究对象，筛选出一系列在乳腺癌中特异表达的基因，作为一种重要的资源，将给以后的研究工作带来很大的方便，为进一步研究乳腺癌新的生物标志物及其治疗靶点奠定了基础。

参考文献

[1]吴晓江，陈克能，徐光炜.乳腺癌新的生物标志物及其治疗靶点—HER2及trastuzumab的研究进展[J].中国癌症杂志,2002, 12(2)

[2]Pinkas-Kramarski R, Eilam R, Alroy I, er al. Differential expression of NDF/neuregulin receptors ErbB-3 and ErbB-4 and involvement in inhibition of neuronal differentiation[J]. Oncogene, 1997, 15 (23): 2803-2805

[3]周津，刘芝华，王秀琴,等.抑制消减杂交及反Northern结合高通量筛选食管癌中差异表达基因[J].科学通报,2002,46(3)

[4]Diatchenko L, Lau YF, Campbe11 AP, et al. Suppression subtractive hybridization: a methodor generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries[J].. Proc Natl Acad Sci U S A,1996, 93 (12): 6025-6030

[5]Earl HM, McIlhinney RA, Wilson P, Gusterson BA, Coombes RC. Immunohistochemical study of beta- and kappa-casein in the human breast and breast carcinomas, using monoclonal antibodies. Cancer Res. 1989 Nov 1;49(21):6070-6

抑制基因蛋白 篇4

用小双链RNA抑制转化入HUVEC中绿色荧光蛋白基因的表达

目的:建立稳定表达绿色荧光蛋白(GFP)的人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs),研究小干扰RNA(siR-NA)对HUVECs中GFP表达的抑制作用.方法:用lipofectamine将编码GFP的质粒pN3-EGFP转入HUVECs中.用G418筛选并维持已转化pN3-EGFP的HUVEC(HUVEC-GFP).利用T7RNA转录试剂盒,制备可抑制GFP基因表达的siRNA(GFPsiRNA)和无关对照的RNA(control siRNA).用oligofectamine将siRNA转入HUVEC-GFP中.继续培养48 h后,检测HUVEC-GFP中GFP蛋白和mRNA表达水平.结果:用G418筛选获得了HUVEC-GFP细胞株,可以观察到GFP的稳定表达.HUVEC-GFP转化siRNA后48 h,GFP的荧光强度明显下降,而对照组的荧光强度无明显下降.半定量RT-PCR检测显示,GFPsiRNA对GFP mRNA表达有较强的抑制作用,抑制率达40%,而control siRNA对GFPmuRNA表达水平无明显的`抑制作用.结论:利用体外转录合成的siRNA能有效地抑制HUVECs中GFP的表达.

作 者：单志新 林秋雄 余细勇 邓春玉 郑猛 谭虹虹 符永恒 杨敏 林曙光 SHAN Zhi-xin LIN Qiu-xiong YU Xi-yong DENG Chun-yu ZHENG Meng TAN Hong-hong FU Yong-heng YANG Min LIN Shu-guang  作者单位：广东省人民医院医学研究中心,广东,广州,510080 刊 名：中国病理生理杂志  ISTIC PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF PATHOPHYSIOLOGY 年，卷(期)： 22(2) 分类号：Q78 关键词：RNA干扰   绿色荧光蛋白   人脐静脉血管内皮细胞   脂质体  

犬瘟抑制蛋白对犬瘟热的疗效观察 篇5

1 材料与方法

1.1 材料

犬瘟抑制蛋白、犬单克隆抗体、犬干扰素、头孢唑啉钠、氨茶碱、氨基比林、地塞米松、5%Na HCOB3B、l0%磺胺嘧啶钠、维生素B1、维生素B6、ATP、辅酶因子、维生素C、10%葡萄糖、林格尔试液及0.9%Na Cl、犬瘟热病毒抗原测试试纸等。

1.2 方法

将24只经试纸化验后呈阳性病犬, 根据就诊先后随机分为6只一组。 (1) 试验组。 (1) 试验组l:犬瘟抑制蛋白 (每支用lml生理盐水溶解按体重20IUkg肌肉注射) 、犬干扰素, 并结合输液 (抗生素和能量合剂等) 对症治疗。 (2) 试验组2:犬瘟抑制蛋白 (每支用1ml生理盐水溶解按体重40IU/kg肌肉注射) 、犬干扰素, 并结合输液 (抗生素和能量合剂等) 对症治疗。 (3) 试验组3:犬瘟抑制蛋白 (每支用lml生理盐水溶解按体重60IU/kg肌肉注射) , 犬干扰素, 并结合输液 (抗生素和能量合剂等) 对症治疗。 (2) 对照组: (1) 犬瘟热单克隆抗体、犬干扰素肌肉注射, 1次/d。 (2) 0.9%Na Cl加上头孢唑啉钠、地塞米松静脉输液, 2次/d。 (3) 林格尔加维生素B。维生素C、ATP、辅酶A、肌苷静脉输液, 2次/d。 (4) 对呼吸道型可应用清开灵注射液加入5%葡萄糖注射液静脉注射, 2次/d。 (5) 对消化道型, 可应用口服思密达, 皮下注射庆大霉素。 (6) 对神经型可应用10%磺胺嘧啶钠, 皮下注射氯丙嗪或安定, 口服安宫牛黄丸。 (7) 对高热型可皮下注射氨基比林, 呼吸症状严重者可肌肉注射氨茶碱。

2 结果

犬瘟抑制蛋白不同剂量对犬瘟热的疗效观察。犬瘟单克隆抗体与犬瘟抑制蛋白治愈数与死亡数康复时间对比情况见附表。

结果表明对照组3号犬后期出现死亡, 治疗第5d症状没有改善、呼吸急促、体温恒高、其精神状态保持良好、用药7d后死亡, 其余恢复良好。试验组l第l号犬与第2号犬病犬前3d良好、第4d精神沉郁、体温升高、鼻镜干裂、第5d l号犬出现脓性鼻液、第7d出现神经症状, 死亡。试验组2第4号犬第8天死亡, 其治疗周期无太大变化, 体温稳定、呼吸正常、精神沉郁、食欲废绝、后期出现严重贫血、最后衰竭致死。试验组3第2号犬死亡, 病犬初期病情良好、食欲旺盛、体温高、呼吸急促、喘特快、第6d出现神经症状、第7d死亡。

3 讨论

根据犬瘟热病毒的结构特点, 筛选出犬瘟抑制蛋白, 其能在机体内高效捕集、特异性的识别和结合犬瘟病毒, 与犬瘟热病毒结合后使犬瘟病毒丧失感染细胞的可能性。其特点为集识别、捕集、结合犬瘟病毒于一体。犬瘟抑制蛋白是一种全新的、特异性的生物制剂。它能高效特异性识别、捕集和结合犬瘟病毒, 阻断犬瘟热病毒侵入细胞的主要途径, 防止犬瘟热病毒内增值, 从而起到抗犬瘟热作用。犬瘟抑制蛋白与犬瘟单抗或血清的相同点是:都是“寻找并结合”犬瘟病毒, 起到抗病毒作用。犬瘟抑制蛋白与犬瘟单抗或血清的不同点: (1) 捕集病毒能力大大提高; (2) 识别位点完全不同, 结合效率大大提高; (3) 结合后病毒不再具有感染性; (4) 可有效封闭病毒侵入细胞的主要途径。因此, 犬瘟抑制蛋白完全替代单抗或血清, 但后者绝不可替代犬瘟抑制蛋白。

4 结论

抑制基因蛋白 篇6

竹笋是指着生于竹鞭或秆基的芽眼经过萌发分化形成的幼嫩芽和茎,在我国南方产量及其丰富,具有较高的食用和药用价值。竹笋中也含有丰富的胰蛋白酶抑制剂,即竹笋胰蛋白酶抑制剂(Bamboo Shoots Trypsin Inhibitor,BSTI),对BSTI进行分离纯化、研究其生化性质使其成为防治血栓、肺气肿、急性胰腺炎和糖尿病及其并发症的新药,应用于临床,具有重要意义。

1 试验方法

1.1 竹笋胰蛋白酶抑制剂的分离纯化

1.1.1 竹笋胰蛋白酶抑制剂粗提取。

竹笋胰蛋白酶抑制剂的粗提方法见文献[6]。

1.1.2 竹笋胰蛋白酶抑制剂的纯化。

试剂:葡聚糖凝胶G25,葡聚糖凝胶G100,葡聚糖凝胶G50,二乙二胺乙基纤维素-葡聚糖凝胶A50;仪器:层析柱、紫外检测器;方法:取1 g粗提物溶解于水中,将蛋白质浓度调节至1%。将5 m L溶液上样到葡聚糖凝胶G25柱中,再将通过柱层析的溶液收集在收集器中,每管5 m L。根据紫外线色谱峰收集到的成分,浓缩成5m L,再通过通过葡聚糖凝胶G50柱(2×93.5 cm)中,用同样的方法收集流出液。再将上述收集液吸附在二乙二胺乙基纤维素-葡聚糖凝胶A50(2.5×21 cm)中。这时吸附柱用p H为6.0的0.05M Na Cl-0.01M的H3PO4缓冲液平衡,并用相同的缓冲液进行梯度洗脱抑制剂。

1.2 竹笋胰蛋白酶抑制剂的活性测定

有2种方法测定胰蛋白酶抑制剂的活性如下:

(1)采用明胶-PAGE活性电泳法,参考文献[7]进行。

(2)采用BNPAN法,按文献[8]进行。

1.3 蛋白质的浓度测定

蛋白质浓度采用Bradford法来测定,标准蛋白采用牛血清蛋白(BSA)。

1.4 热稳定性实验

分别将一定浓度的抑制剂在不同温度下(40℃,50℃,60℃,70℃,80℃,90℃,100℃)水浴处理15min,拿出后迅速冷却,按照1.2(1)和(2)活性测定方法检测其抑制活性。

1.5 等电点的测定

采用等点聚焦(EIF)电泳法测定,参照文献[9]方法进行。

1.6 重金属对BSTI活性的影响

分别将BSTI与用含Mn SO4,Zn SO4,Cu SO4,Fe SO4,Cd Cl2,Co Cl2,Hg Cl2,Ag NO3溶液混合,室温下处理24 h后,按照1.2(2)的方法检有无抑制活性。

1.7 氧化剂对BSTI活性的影响

分别将BSTI与用含KMn O4,I2,Fe Cl3溶液混合,室温下处理24 h后,按照1.2(2)的方法检有无抑制活性。

1.8 还原剂对BSTI活性的影响

分别将BSTI与用含Na2SO3,Na2S2O3,Na2S,维生素C溶液混合,室温下处理24 h后,按照1.2(2)的方法检有无抑制活性。

1.9 螯合剂对BSTI活性的影响

分别将BSTI与用含EDTA,KCN,喔星溶液混合,室温下处理24 h后,按照1.2(2)的方法检有无抑制活性。

2 结果与分析

2.1 竹笋胰蛋白酶抑制剂的分离纯化

竹笋经水抽提,热变性,35%~65%饱和硫酸铵分部沉淀,溶解水后上葡聚糖凝胶G25柱在第16-17份中含有抑制剂,检测的浓度约为硫酸铵沉淀中的40倍。把上述流份浓缩成5 m L后,再通过葡聚糖凝胶G100柱中,进而把流出液收集在流份收集器内,每份5 m L,取28~38份流出液,测得抑制剂浓度约为硫酸铵沉淀中的100倍。而后将上述流份浓缩成5m L后,通过葡聚糖凝胶G50中,用同样的方法收集第22~36份的流出液,此时抑制剂的浓度约为硫酸铵沉淀的170倍。再将上述收集液吸附在二乙二胺乙基纤维素-葡聚糖凝胶A50柱中。这时吸附柱用这时吸附柱用p H为6.0的0.05M Na Cl-0.01M的H3PO4缓冲液平衡,并用相同的缓冲液进行梯度洗脱抑制剂。这时没有抑制剂活性的蛋白质不吸附,而抑制剂则完全吸附。

梯度洗脱可得到5个分离峰,其中抑制剂含量最多的是第2个峰,以5 m L为一份收集流份,收集Na Cl浓度为0.12~0.15克分子洗脱的流出液,即第81~120流份。这时抑制剂浓度约为硫酸铵沉淀中的1 000倍。

把上述收集液经过同样浓缩后,再通过葡聚糖凝胶G50柱。这时经过凝胶过滤可得到均质的抑制剂,其浓度约为硫酸铵沉淀中的1 200倍。SDS一PAGE显示纯化胰蛋白酶抑制剂为单一条带,说明纯化成功(图1)。在渗析后冷冻干燥,可制得无色的胰蛋白酶抑制剂标准品。

2.2 蛋白质浓度测定

以牛血清蛋白BSA为标准蛋白,蛋白质标准曲线如图2,得到纯品浓度为0.628μg/μL。

2.3 热稳定性

在水浴中以不同的温度(40、50、60、70、80、90、100℃)处理15 min后,以1.1(2)BNPAN法检测抑制活性,结果见表1。表1结果显示,经100℃热变性15 min后,BSTI仍保持50%的抑制活性,结果表明BSTI有较强的热稳定性。

2.4 等电点

经等电聚焦检测,只显示一条带,BSTI的等电点为4.4左右。

2.5 重金属对BSTI活性的影响

重金属对BSTI活性影响见表2。由表可以看出BSTI在Co Cl2溶液中还有94.7%,可见BSTI相当稳定,但是在Fe SO4溶液中活性却完全被压制。

2.6 氧化剂对BSTI活性的影响

氧化剂对BSTI活性影响见表3。由表可以看出BSTI在氧化剂中活性不高。

2.7 还原剂对BSTI活性的影响

还原剂对BSTI活性的影响见表4。由表4可以看出几种还原剂对其活性有一定的抑制,但是维生素C不仅不会抑制其活性反而能够提高它的活力。

2.8 螯合剂对BSTI活性的影响

螯合剂对BSTI活性的影响见表5。从表5中能看出KCN能大幅提高BSTI的活性,其他两个螯合剂会抑制其活性。

3 讨论

竹笋胰蛋白酶抑制剂的热稳定性比较高,甚至在100℃下水浴15 min还有50%的抑制活性。虽然在很多报道中有报道其他胰蛋白酶抑制剂有一定的耐热性,但是在100℃下水浴10 min以上还有很强活性的,极少报道,说明BSTI是已知胰蛋白酶抑制剂中耐热性出类拔萃的。

利用天然等电聚焦制作标准曲线来测定BSTI的等电点,测定得到BSTI的等电点为4.44。在同一次等电聚焦中,用标准品牛血清白蛋白(BSA)测的BSA等电点为4.56,而实际查得BSA等电点为4.6左右,与笔者测定得到的BSA等电点相差无几。所以我们测定得到的BSTI的等电点应该是可信的。

4 结论

笔者从竹笋中分离纯化得到了一种新的胰蛋白酶抑制剂BSTI。性质研究表明,BSTI的分子量为20~30 Dk;PI值为4.44;BSTI的热稳定性非常好。此外,本文还对重金属、氧化剂、还原剂、螯合剂对BSTI的影响进行了研究,结果表明:在大部分重金属中,BSTI的稳定性比较好;氧化剂对它的影响比较大,均会抑制器活性;还原剂Na2SO3影响小,Na2S2O3和Na2S抑制比较明显,但是维生素C对其活性反而有促进作用;螯合剂对其活性影响相对较小,KCN对其活性还具有促进作用。

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胃癌相关基因及蛋白分子研究进展 篇7

1 胃癌相关基因

肿瘤相关基因在肿瘤的发生及发展中扮演重要角色,肿瘤的发生与癌基因的激活和抑癌基因的失活密切相关,肿瘤的侵袭转移及发展和肿瘤转移基因及肿瘤转移抑制基有密切联系。相关基因的多态性与肿瘤的易感性及临床病理表型亦有关联。

1.1 胃癌相关癌基因

癌基因(Oncogene)是指细胞内或病毒内存在的,能诱导正常细胞发生转化,使其获得一个或更多新的生物学特性的基因。根据癌基因的来源及特性的不同,将其分为病毒癌基因、细胞癌基因或原癌基因。胃癌的发生主要与原癌基因的激活和过表达有关,原癌基因在一定条件下可被激活,参与细胞恶性转化及肿瘤发生的过程。因此原癌基因是细胞潜在的癌基因。胃癌相关癌基因主要有ras、p53突变型、c-ymc、 survivin、Bcl-2等基因。

1.1.1 ras基因

在人类肿瘤中,ras基因家族包括三个功能基因,即H-ras、K-ras和N-ras。H-ras定位于11p、K-ras定位于12p、N-ras定位于1p。它们编码一种高度相似分子量为2100kD的蛋白质P21蛋白。P21蛋白分布于质膜内侧,具有GTP酶活性,在膜受体到腺苷环化酶信号传导中起重要作用。Ras-P21如果处于持续结合GTP的活化状态,则可能引起细胞的异常增殖,导致肿瘤的发生。Seto等[2]也再次证明了RAS信号在胃癌发生发展中的重要性。

1.1.2 突变型p53基因

正常p53基因的功能像“分子警察”(Molecular police man),监视着细胞基因组的完整性。某些情况下,p53基因编码区的点突变和 p53等位基因的缺失可导致p53基因突变,突变的 P53蛋白不能引起细胞增殖的停滞或凋亡,导致细胞生长失控,肿瘤发生[3]。Uchino等[4]研究表明,p53基因突变在胃癌形成和发展中比较常见。

1.1.3 c-ymc基因

c-myc基因是髓细胞白血病病毒癌基因的同系物,定位于人类染色体8q24,编码一种P62核蛋白。1985年Shibuya首次在部分胃癌细胞中发现c-myc基因扩增和高表达。Zhang等[5]探讨了c-ymc基因对胃癌细胞株SGC7901和胃癌细胞系HFE145的生长、增殖、凋亡、侵袭和细胞周期方面的影响。他们的研究表明,c-ymc基因能促进正常胃细胞的生长和增殖,并帮助维持肿瘤细胞恶性表型,下调c-myc基因能抑制胃癌细胞的生长和扩散。但他们并未观察到c-ymc基因对胃癌细胞侵袭能力的影响。

1.1.4 survivin基因

Ambrosini等[6]首次分离出survivin基因,此基因全长15kb,定位于17q25,含3个内含子和4个外显子,编码l42个氨基酸组成的蛋白质,分子量约16.5kD。Survivin是凋亡抑制蛋白(Inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族中的一员。具有抗凋亡的特征性结构:较为保守的N端BIR结构域,缺乏RING锌指的C端α螺旋结构,以及2个剪接变构体(Survivin-DeltaEx3与Survivin-2B);而且具有特异性的抗凋亡效应通路:对caspase-3和/或caspase-7的直接和/或间接作用途径,以及对纺锤体装置的调节途径。Wenying等[7]将survivin特定的siRNA转染到人胃癌细胞株MGC-803,然后评估survivin的表达、细胞增殖和细胞凋亡情况。他们利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR法)测定survivin mRNA的表达,Western blot检测survivin蛋白的表达,流式细胞仪检测细胞周期分布和细胞凋亡。该研究数据表明,针对survivin基因的siRNA能抑制胃癌细胞的增殖和诱导凋亡,他们再一次证明survivin基因与胃癌发生发展相关,并且siRNA的使用可能为胃癌基因治疗提供新的方法。

1.1.5 bcl-2基因

1984年Tsujimoto首先发现B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)基因,可编码翻译出Bcl-2蛋白。随后相继在多种人类肿瘤中发现Bcl-2高水平表达,可广泛抑制各种刺激因素诱导的细胞凋亡,从而延长细胞活力发挥生物学作用。研究表明,Bcl-2的表达在胃肿瘤的发生发展中起着重要的作用[8]。Cho等[9]研究表明,Bcl-2表达的消耗显著增加顺铂诱导过度表达RhoGDI2胃癌细胞的凋亡,而Bcl-2的过度表达,则阻断顺铂诱导的胃癌细胞凋亡。这项研究说明bcl-2基因的表达可抑制胃癌细胞的凋亡,与胃癌的发生发展密切相关,并可通过调节bcl-2基因的表达对胃癌进行治疗,研发胃癌治疗的新策略。

1.2 胃癌相关抑癌基因

抑癌基因是一类可抑制细胞生长,并能潜在抑制细胞癌变作用的基因群,它仅在某一种特定细胞内起作用。与胃癌相关的抑癌基因主要有p53野生型、Rb、PTEN、WWOX等基因。

1.2.1 野生型p53基因

野生型p53基因可编码翻译出p53蛋白,对细胞周期中的增殖细胞具有调控作用,能控制G0或G1期细胞进入S期,从而抑制细胞的增殖。故野生型p53基因是一种肿瘤抑制基因。Goncalves等[10]对80例早期胃癌患者进行研究表明,野生型p53基因阴性患者的生存时间比阳性患者短,进一步说明野生型p53基因编码出的蛋白对胃癌细胞具有抑制及促凋亡作用。

1.2.2 Rb基因

Rb基因是最早发现的抑癌基因,在去磷酸化(活化形式)通过结合并阻断某些转录因子而抑制细胞从G1期进入S期,阻断细胞转录,抑制DNA合成。故Rb功能的缺失可导致细胞周期的紊乱,引起细胞非控制性增殖而导致肿瘤的发生。Mattar等[11]使用PCR对22例丧失杂合性Rb基因进行研究表明,Rb基因的失活与胃癌的形成紧密相关。

1.2.3 PTEN基因

PTEN是一个具有特异性磷酸酶活性的抑癌基因,该基因的突变失活与人类多种恶性肿瘤的发生发展密切相关。Hino等[12]研究发现PTEN蛋白的表达与胃癌组织分化程度呈正相关,恶性程度高者PTEN蛋白失表达或弱阳性,PTEN的水平越低其预后越差。

1.2.4 WWOX基因

Bednarek等[13]用鸟枪法及相关技术克隆出氧化还原酶(WWOX)基因。WWOX编码包含氧化还原酶的WW域(WW domain-containing oxidoreductase,WWOX),参与细胞周期的调节和介导凋亡。据报道,抑癌基因WWOX在胃癌及其他肿瘤中有所下调,Yan等[14]的研究结果表明,在胃癌中WWOX基因通常都有甲基化,与幽门螺旋杆菌(H.pylori)感染也有显著相关。

1.3 胃癌转移相关促进基因

肿瘤细胞可通过血管或淋巴管进行转移,相关基因的表达可促进肿瘤的侵袭和转移,此类基因被称为肿瘤转移促进基因。与胃癌相关的肿瘤转移促进基因主要有snail、CD44s等基因。snail是研究较多的与肿瘤密切相关的基因之一,snail在胃癌中发挥癌基因的作用,其mRNA过表达可促进胃癌的发生、浸润和转移。有实验结果显示:snail mRNA在不同胃癌细胞系中差异表达,snail在分化程度越低的胃癌细胞中表达越高,提示snail在胃癌中发挥癌基因的作用,其mRNA过表达可促进胃癌的发生、浸润和转移[15]。CD44基因位于染色体11号短臂上(11P),共有20个外显子构成。有关研究表明,多种肿瘤的转移行为均与CD44基因的异常转录有关,CD44s 促进胃癌的浸润和转移[16]。

1.4 胃癌转移相关抑制基因

相关基因的表达可抑制肿瘤的侵袭和转移,此类基因被称为肿瘤转移抑制基因。与胃癌相关的肿瘤转移抑制基因主要有nm23、BRMS1、KISS-1、NDRG-1等基因。nm23基因是第一个被发现的转移抑制基因,在肿瘤细胞的增殖、分化和侵袭转移中起重要作用[17]。有研究表明,nm23基因的阳性表达率与胃癌的组织学分级、分化程度、淋巴结转移和临床分期等密切相关,提示nm23基因在胃癌的转移瘤形成阶段具有抑制肿瘤转移的作用,并与CD44s的促胃癌转移作用相拮抗[16]。众多研究证实,乳腺癌转移抑制基因(BRMS1)与多种恶性肿瘤的转移和浸润密切相关。BRMS1基因对胃癌的转移也具有抑制作用,可望成为胃癌转移的分子生物学标志之一[18]。KISS-1基因是1996年克隆出的一个肿瘤转移抑制基因,但KISS-1基因与胃癌的侵袭转移相关性研究报道较少,Zheng等[19]研究表明,KISS-1基因的低表达与胃癌淋巴结转移有着密切的联系。NDRG-1基因又称分化相关基因,有研究表明,NDRG-1基因具有明显的肿瘤转移抑制作用。Jiang等[20]研究显示NDRG-1在肿瘤的形成及阻止胃癌细胞的转移和侵袭中具有重要作用。NDRG1可以发展作为胃癌诊断和评估预后的指标,同时可作为胃癌潜在的药物治疗靶标。

1.5 胃癌相关基因多态性

基因多态性(Genetic polymorphism)是指在一个生物群体中,同时和经常存在两种或多种不连续的变异型或基因型(Genotype)或等位基因(Allele),亦称遗传多态性。相关基因多态性与特定疾病的易感性及临床表型密切相关。

胃癌易感性及临床表型与基因多态性亦有密切关联。研究证实,胰岛素受体底物-2(IRS-2)G1057D多态性与中国人口胃癌的风险增加相关[21]。Tian等[22]第一次表明,个体携带AA ICAM-1 K469E多态性基因型更容易患GC。此外,与其他胃癌患者相比,AA基因型患者更有可能发生远处转移和有更高的死亡风险。这些结果表明,ICAM-1 K469E多态性可以用来作为一种新的分子标记筛选高风险GC个体和预测疾病的进展,并指导个体化治疗。Xue等[23]通过系统回顾和荟萃分析,探讨了IL-8-251的A/T单核苷酸多态性在胃癌易感性中的作用。他们的荟萃分析表明,IL-8-251AA基因型与胃癌发展风险相关。更值得注意的是IL-8-251AA基因型与肠型胃癌密切相关。白细胞介素10(IL10)基因的变异和环境因素都被认为可导致炎症和胃癌。Kim等[24]调查了IL10基因多态性与非贲门胃癌发生之间的关联。他们发现IL10-819C和592C等位基因有完整的连锁不平衡,表明IL10基因多态性与肠型非贲门胃癌的风险增加有关。

2 胃癌相关蛋白

胃癌的发生发展不仅伴有相关基因的变化,多项研究显示胃癌的发生及侵袭转移还与相关蛋白有着密切的联系。

2.1 胃癌相关癌蛋白

MCM2、磷酸肌醇3激酶(PI3K)、人表皮生长因子受体2(HER2)等蛋白的表达可促进胃癌的发生及侵袭转移。MCM2的高表达提示胃癌细胞具有较强的浸润转移能力,预后差[25]。磷酸肌醇3激酶(PI3K)/Akt途径在人类肿瘤,包括胃癌细胞增殖和生存起着根本性的作用。Shi等[26]用直接测序和实时定量PCR技术,研究了PIK3CA突变和扩增与胃癌患者的临床病理特征和临床疗效间的关系。他们的数据表明,PIK3CA突变并不常见,但其扩增在胃癌中是很常见的,并可能是在胃癌中激活PI3K/Akt通路的主要机制。重要的是,Kaplan-Meier生存曲线显示PIK3CA扩增与胃癌患者的存活率较差显示正相关[27]。通过免疫组织化学(IHC)和原位杂交显色(CISH)评估了HER2在胃癌及对应淋巴结转移中的作用。该研究结果表明,HER2蛋白过度表达可促进胃癌的淋巴结转移。

2.2 胃癌相关抑癌蛋白

Rb基质金属蛋白酶MMP-9、CacyBP、Raf激酶抑制蛋白(Rafkinaseinhibitorprotein,RKIP)等蛋白的表达对胃癌的发生及侵袭转移有抑制作用。Rb基因编码翻译产物Rb蛋白对多种肿瘤的发生及侵袭转移具有抑制作用。相关研究[25]显示,Rb蛋白的低表达提示胃癌细胞具有较强的浸润转移能力。MMP-9可降解破坏细胞外基质组成成分、型胶原和明胶,对恶性肿瘤的侵袭和转移具有抑制作用[28]。国内有研究表明,MMP-9对胃癌的浸润和转移具有抑制作用[29]。Calcyclin结合蛋白(CacyBP蛋白/SIP)是一个30kD的蛋白,Ning等[30]研究表明, CacyBP蛋白/SIP的过表达可抑制胃癌的生长。RKIP是一种高度保守、具有多种生理与病理功能的小分子胞浆蛋白。Jia等[31]含有全长RKIP的真核基因表达载体转染到人胃癌细胞株MKN45,然后观察胃癌细胞侵袭和转移能力的变化。他们研究结果显示RKIP的过度表达显著降低MKN45细胞的侵袭和转移能力。

3 总结与展望

抑制基因蛋白 篇8

Kazal型蛋白酶抑制剂结构与功能研究进展

蛋白酶抑制剂广泛存在于生物体内,在许多生命活动过程中发挥必不可少的作用,特别是对蛋白酶活性进行精确调控.其中Kazal型蛋白酶抑制剂是最重要的、研究最为广泛的酶抑制剂之一,该类抑制剂一般由一个或几个结构域组成,每一个结构域具有保守的序列和分子构象,同时发现该类抑制剂与蛋白酶作用的结合部位高度易变,它们大多数暴露于与溶剂接触的环上,其中P1部位是抑制作用的关键部位,抑制剂的专一性由P1部位氨基酸残基的`性质决定,其它残基取代结合部位残基对抑制剂-酶的结合常数有显著的影响.Laskowski算法可直接从Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂的序列推测其与6种丝氨酸蛋白酶之间的抑制常数(Ki).目前在生物体内发现大量的Kazal型蛋白酶抑制剂,并证实其有重要的生物学功能.

作 者：郑青亮 盛清 张耀洲 ZHENG Qing-Liang SHENG Qing ZHANG Yao-Zhou 作者单位：浙江理工大学生命科学学院,生物化学研究所,杭州,310018刊 名：生物工程学报 ISTIC PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY年，卷(期)：22(5)分类号：Q81 R373关键词：Kazal 型蛋白酶抑制剂 Laskowski 算法 活性部位

抑制基因蛋白 篇9

鹅细小病毒病又称小鹅瘟[2]。以雏鹅小肠纤维素性、栓塞性病变为主要特征[3,4], 具有病程短促、传播快、死亡率高等特性。番鸭细小病毒病俗称三周病[5], 以腹泻、气喘及胰脏坏死和出血为主要特征, 发病率与死亡率达40%~50%。

1995年, Z.Zádori等[6]首次发表了鹅细小病毒与番鸭细小病毒的全基因组序列。基因组含2个开放阅读框 (ORF) 。左侧ORF编码2个非结构蛋白NS1和NS2, 主要参与病毒DNA的复制及调节基因的表达;右侧ORF编码3个结构蛋白VP1、VP2和VP3, 其中VP3是主要的衣壳蛋白, 含有免疫保护性抗原[6,7], 能诱导产生具有中和作用的抗体。

1 材料与方法

1.1 毒株与主要试剂

大肠杆菌DH5α感受态细胞、番鸭细小病毒DK、DYL毒株和鹅细小病毒ZJ、G3、LJY毒株, 均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所水禽细菌病研究组保存;DNA提取试剂盒和质粒小提纯化试剂盒, 购自杭州爱思进生物技术有限公司;r Taq DNA聚合酶、胶回收试剂盒, 购自上海华舜生物技术有限公司;p MD18-T载体, 购自宝生物工程 (大连) 有限公司。

1.2 引物

根据Gen Bank中全基因组序列, 对番鸭细小病毒和鹅细小病毒分别设计2对引物, 见表1, 引物均由博仕生物技术有限公司合成。

1.3 病毒核酸片段的PCR扩增

参照DNA提取试剂盒说明书提取病毒DNA, -20℃保存, 备用。PCR体系 (总体积为50μL) :病毒DNA 3μL, 相应上、下游引物 (20 pmol/L) 各1μL, r Taq DNA聚合酶25μL, 用dd H2O补充至50μL。扩增程序:94℃5 min;94℃30 s, 54℃30 s, 72℃1 min, 共30个循环;72℃10 min, 最后于4℃保存, 备用。

1.4 病毒基因的克隆、序列测定与分析

参照胶回收试剂盒说明书进行纯化回收, 用p MD18-T载体连接, 连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞, 涂布于含氨苄西林的LB琼脂平板上, 37℃倒置培养12~16 h, 采用PCR方法鉴定重组质粒, 阳性质粒送博仕生物技术有限公司测序。用Lasergene v7.1 DNAStar软件进行序列拼接, 并与GenBank中的其他基因序列比对分析。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增结果

用2对引物扩增得到的PCR产物大小均为1 000 bp, 扩增结果与预期片段大小相符, 见图1。

2.2 序列分析

利用Lasergene v7.1 DNAStar软件进行序列拼接后, 得到的鹅细小病毒和番鸭细小病毒结构蛋白基因序列大小为2.1 kb, 利用Meg Align中的Clustal W方法, 对DK、DYL、ZJ、G3、LJY这5株毒株序列与其他16株基因组序列 (其中鹅细小病毒序列13个, 番鸭细小病毒序列3个) 结构蛋白的氨基酸序列进行比对, 观察其同源性。

1.DL-2 000 Marker;2~3.PCR扩增结果。

结构蛋白包括VP1、VP2和VP3, 终止于同一个密码子, 长度分别为2 199, 1 764, 1 605 bp, 分别编码732, 587, 534个氨基酸。

鹅细小病毒VP1蛋白氨基酸序列的同源性为95.1%~100%, G3、ZJ和LJY毒株之间VP1蛋白的同源性分别为96.9%、96.2%、96.3%;番鸭细小病毒之间的同源性为96.9%~99.3%, DYL和DK毒株之间的同源性高达98.9%;鹅细小病毒和番鸭细小病毒之间的同源性为85.1%~88.3%, 鹅细小病毒ZJ毒株与番鸭细小病毒FM毒株之间同源性最低 (85.1%) 。

鹅细小病毒VP2蛋白氨基酸序列的同源性为95.2%~100%, G3、ZJ和LJY毒株之间的同源性分别为96.1%、96.3%和97.4%;番鸭细小病毒之间的同源性为96.6%~99.3%, DK和DYL毒株之间的同源性为98.6%;鹅细小病毒和番鸭细小病毒之间的同源性为85.5%~88.1%, 鹅细小病毒ZJ毒株与番鸭细小病毒FM、DK毒株之间的同源性最低 (85.5%) 。

鹅细小病毒VP3蛋白氨基酸序列的同源性为95.0%~100%, G3、ZJ和LJY毒株之间的同源性为96.3%、96.3%和97.9%;番鸭细小病毒之间的同源性为96.8%~99.4%, DK与DYL毒株之间的同源性为98.5%;鹅细小病毒与番鸭细小病毒之间的同源性为88.4%~91.0%, 番鸭细小病毒DK毒株与鹅细小病毒GDa GPV毒株之间的同源性最低。

结构蛋白在氨基酸水平上, 同为鹅细小病毒的3个毒株与标准毒株B相比分别有41, 79, 74个碱基差异, 引起的氨基酸改变分别有23, 30, 17个;而番鸭细小病毒DK毒株与DYL和FM毒株相比有43, 35个碱基改变, 引起的氨基酸改变分别有23, 17个。无论是鹅细小病毒毒株还是番鸭细小病毒毒株, 氨基酸改变主要集中在VP3区域, 并且鹅细小病毒较番鸭细小病毒变化较多。通过Net NGlyc 1.0 Server预测潜在糖基化位点, 发现番鸭细小病毒2个毒株均含有8个糖基化位点, 而鹅细小病毒一般只有4~6个糖基化位点, 除了均存在与番鸭细小病毒相同的前2个位点 (即219~221 NAS和331~333 NLT) 外, 不同鹅细小病毒毒株在VP区缺少1~2个位点。ZJ毒株含有全部6个糖基化位点, 而G3和LJY毒株只含有5个糖基化位点, 分别缺少582~584 NTT和703~705NRT。

2.3 进化分析

利用Mega5.2软件中Neighbor Joining (NJ) 法绘制结构蛋白的遗传进化树。在结构蛋白基因水平上, 鹅细小病毒可分为2个基因亚群, 即a亚群和b亚群, 见图2~4。a亚群为中国亚群, 主要包括中国大陆各地区及台湾省的毒株, LJY毒株就位于这个亚群, 与安徽E株接近;b亚群为混合亚群, 其中包含中国台湾省、匈牙利及德国的毒株, G3和ZJ毒株位于这个亚群, 与德国VG32/1毒株接近。同为番鸭细小病毒的DK和DYL毒株与上海市的P毒株比较接近。

3 讨论

1995年, Z.Zádori等[6]首次发表了鹅细小病毒与番鸭细小病毒的全基因组序列, 了解到2种细小病毒的基因组都包含2个ORF, 右侧的ORF编码结构蛋白VP1、VP2和VP3, 其中编码结构蛋白的3个基因是2种细小病毒的主要免疫原基因, 且在病毒装配过程中, VP3蛋白主要在病毒衣壳的表面, 是病毒最主要的保护性抗原。VP3蛋白为病毒提供了保护性抗原, 那么它的多变就可以更好地避免外界对病毒自身的破坏。鹅细小病毒相对于番鸭细小病毒在结构蛋白VP3区域变化较多, 这就使得鹅细小病毒可以更好地逃避宿主的免疫系统, 从而导致鹅细小病毒感染鹅与番鸭;而番鸭细小病毒只能感染番鸭。相对于番鸭细小病毒, 鹅细小病毒糖基化位点的缺失从另一个角度说明了免疫逃逸的问题, 糖基化位点是病毒感染宿主必不可少的区域, 那么它的缺失就会产生不同的宿主范围。有研究猜测, 糖基化位点的缺失还可能与毒力的改变有关, 但是否有直接关系, 还需要进一步研究。当糖基化位点数目相同时, 缺失不同位置的糖基化位点对毒株的影响也同样需要进一步研究。从遗传进化树的分析结果可以看出, 鹅细小病毒结构蛋白有明显的遗传特性, 但不同地区的毒株有较高的亲缘性, 这可能是由于水禽业的发展, 各地区的品种改良及外来品种的引进加速了不同地区病毒基因的交流, 使其更加多样化, 然而番鸭细小病毒的遗传特性不甚明显, 没有明显的分支, 基因组同源性相对较高, 糖基化位点也一直保持不变, 到底是什么原因导致番鸭细小病毒相对低变, 还需要进一步分析。

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抑制基因蛋白 篇10

1 PIs在体外和临床前期相关的肿瘤活体研究

PIs对人类细胞有着广泛的毒性作用, 但也被赋予有效的抗癌特性[3]。 尽管它们与HIV蛋白酶有一定的同源性,但考虑其抗肿瘤活性,细胞蛋白酶似乎是蛋白酶抑制剂的主要靶点,尤其是蛋白酶体和基质金属蛋白酶(MMPs)。 从Gills等[4]的一项研究中获悉, PIs对美国国家癌症研究所平台的所有60个细胞系(NCI60 cell-lines)均有抗癌活性,同时描述了多个潜在的抗肿瘤作用机制,包括内质网应激、自噬、凋亡以及抑制Akt通路。 多种肿瘤发生的重要共同点是PI3K/Akt/m TOR信号通路的激活,因此这一途径的抑制剂已被作为抗癌药物而开发。 Gills等[5]对结构蛋白相互作用的综合分析发现, 在被预测的92种奈非那韦作用的细胞靶点中,7种最强亲和力的靶点是依赖天冬酰胺蛋白酶的,其余的靶点主要是依赖蛋白激酶的, 如Akt、NFαB的上游调控因子———生长因子受体, 以及那些已知的被奈非那韦下调的其他信号分子。 PIs也有可能不利于肿瘤治疗,如KS细胞多药转运体ABCB1(P-糖蛋白)表达的增强,使得KS细胞具有抗多柔比星和紫杉醇化疗的特性[6]。

2 PIs的抗肿瘤机制

2.1 PIs抑制血管生成和细胞侵袭

在对PIs抗肿瘤活性的研究中发现,茚地那韦和沙奎那韦是强效的血管生成抑制剂,在小鼠KS模型中它们通过阻断MMP2活化来阻止肿瘤细胞侵袭[7], 随后的研究发现,利托那韦和沙奎那韦可阻断MMP2和MMP9的活化来阻止宫颈上皮内瘤样病变细胞的侵袭[8]。 在裸鼠实验中,安普那韦也表现出通过阻断MMP2活化来阻止肝细胞癌的侵袭和肿瘤生长[8]。 此外,PIs可以通过下调一些信号通路来阻止血管生成, 如下调PI3K/Akt通路来调节参与新生血管形成的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和许多其他因子的调节[9,10]。

2.2蛋白酶抑制剂抑制Akt

PI3K/Akt信号通路及其下游调控因子 ———如哺乳动物的雷帕霉素靶子(mammalian target of rapamycin, m TOR)和VEGF具有参与细胞增殖、运动、血管新生、 细胞变形、 凋亡/生存以及DNA损伤修复等多种功能[11]。 上调PI3K/Akt信号通路可以防止细胞凋亡,从而使多种肿瘤对放疗和化疗不敏感。 在多种肿瘤细胞系中,PIs可以抑制Akt磷酸化[4,12]。 尽管PIs在不同肿瘤细胞类型中表现不一,但奈非那韦似乎是众多PIs中最强效的Akt抑制剂[4]。 在抗雷帕霉素的弥漫大B细胞淋巴瘤细胞系中,Akt的活化上调,与雷帕霉素联合应用的奈非那韦或Akt抑制剂MK-2206导致细胞毒作用[13]。 一份有关HIV感染患者的观察性研究表明[14], 不服用PIs的抗逆转录病毒治疗组或不接受抗病毒药物组与服用以奈非那韦为基础的抗逆转录病毒治疗组相比,后者白细胞中Akt磷酸化水平较低。 此外, 奈非那韦与辐射毒性的增加不相关[14]。 然而,Akt被抑制的水平并不总是与抗肿瘤活性相关,在一些模型系统中奈非那韦未能激活Akt通路[15,16]。 PIs通过PI3K阻止Akt磷酸化的确切机制仍未知,可能通过抑制上游生长因子,诱导内质网应激或产生其他影响[15]。

2.3 PIs诱导内质网应激

当积累的错误折叠的蛋白质或其他应力破坏了内质网平衡,未折叠蛋白反应(unfolded protein re- sponse,UPR)被触发,从而导致蛋白翻译受阻和细胞周期阻滞[17,18]。 奈非那韦和其他PIs可以引起ER应激[19]。 在脂肪肉瘤和去势抵抗前列腺癌细胞株(具有脂肪性表型)中,奈非那韦通过抑制位点2蛋白酶诱导ER应激, 导致与固醇调节元件相结合的蛋白-1 (SREBP-1)受损,以及激活转录因子6[20]。 这正好验证了所知PIs的毒性———脂肪代谢不良, 可能是由SREBP-1水平的增加引起的[1]。 正确的蛋白质折叠是由分子伴侣协助完成的, 错误折叠的蛋白质的降解主要在蛋白酶体进行。 因此,通过PIs干扰上述功能会导致ER应激[21]。 Liu等[22]研究指出洛匹那韦和利托那韦通过激活ER应激来增加头颈部鳞癌细胞对放疗的敏感性。 奈非那韦还具有抗蛋白酶体的细胞类型依赖性[16,23]。 然而在一项研究中,奈非那韦抑制乳腺癌细胞裂解物从而部分抑制蛋白酶体活性,但引起ER应激机制不同于蛋白酶体抑制剂[15]。 相反, 有其他研究证据表明, 奈非那韦的主要目标似乎是分子伴侣———热休克蛋白90, 引起内质网应激并破坏Her2和Akt信号通路[24]。 基于体外和小鼠模型,在多种类型的肿瘤(包括单独耐硼替佐米的肿瘤)中, 一种PIs(奈非那韦或利托那韦)与蛋白酶体抑制剂硼替佐米的联合应用可以增强内质网应激和细胞杀伤[14,25]。 ER应激和UPR可导致自噬,如果内质网平衡可以再建立则细胞可存活, 否则会导致细胞凋亡和细胞死亡。

2.4 PIs诱导细胞自噬

自噬是一种普遍存在且进化高度保守的细胞内蛋白降解程序, 其通过膜运动将非折叠及错叠蛋白、 大分子以及损伤或衰老的细胞器送入溶酶体进行降解。 其中蛋白质和细胞器被降解并再循环或作为细胞稳态的正常部分,或为了生存让细胞度过一段营养饥饿期[26]。 除了养分饥饿,自噬可由PIs引起的PI3K/Akt通路的抑制而被触发[27]。 自噬可以通过降解非折叠及错叠蛋白减少ER应激,相反地,抑制自噬可引起ER应激而导致细胞死亡。 因此,自噬可以保护癌细胞免于死亡, 拮抗细胞自噬可以通过诱导ER应激/UPR的方法达到治疗效果。 例如,3-甲基腺嘌呤是一种自噬抑制剂,在多种肿瘤细胞系中,它可以增加奈非那韦诱导的细胞死亡量[4]。 氯喹也是一种自噬抑制剂,在三阴性乳腺癌(即雌激素、孕激素及Her2均为阴性的乳腺癌)细胞中,它可以协同增强由奈非那韦或塞来昔布诱导的ER应激引起的细胞毒作用[28]。 在14例原发性慢性淋巴细胞白血病细胞中, 奈非那韦可触发ER应激和自噬[29]。

2.5 PIs诱导细胞凋亡

细胞凋亡指为了维持内环境稳定,由基因控制的细胞自主有序的死亡。 与细胞坏死不同,凋亡不是一件被动的过程,而是主动过程,它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等作用。 研究发现在多种不同的细胞系中,PIs可通过诱导ER应激和UPR途径抑制PI3K/Akt活性及其他信号通路如STAT3、c -Src和NFαB等从而诱导细胞凋亡[10,12,28,30,31]。 PIs可能会通过抑制IαB蛋白酶体降解来抑制NFαB激活,诱导细胞凋亡[10,32]。

3临床肿瘤试验

三项有关奈非那韦联合放化疗的I期研究已完成。 在胰腺癌患者中,奈非那韦联合吉西他滨、顺铂进行放化疗, 可以增强Akt抑制水平和增加放疗敏感性, 而且并没有发现奈非那韦引起的毒性反应[33]。 Rengan等[34]指出在无法手术切除的非小细胞肺癌患者中,奈非那韦联合依托泊苷、顺铂放化疗,也未发现奈非那韦剂量依赖的毒性反应。在Alonso-Basanta等[35]进行的I期临床试验中, 口服最大耐受剂量(MTD)的奈非那韦和替莫唑胺联合放疗,大多数胶质母细胞瘤患者对此是耐受的, 这些人将进行Ⅱ期临床试验,仅有少数出现肝毒性和腹泻。 此外,还有数项临床肿瘤实验已完成或正在进行,在Gideon等[36]进行的I期临床试验中,找出了奈非那韦在晚期实体肿瘤应用中的MTD和剂量限制性毒性(DLT),而且奈非那韦用量在超过FDA规定标准剂量的2.5倍下肿瘤患者也是可耐受的,显示出奈非那韦具有良好的可耐受性。

4结论

在对HIV相关恶性肿瘤的临床研究中发现,PIs对多种肿瘤具有潜在的治疗作用。 PIs能够通过多种途径阻止肿瘤的生长和侵袭。 在PIs中,奈非那韦似乎最有希望用于肿瘤的治疗,并且一些临床试验已经开始进行,并显示其具有良好的耐受性和有效性。 现在正进行有关利托那韦、 洛匹那韦和地瑞那韦三种PIs对结直肠癌细胞HCT116细胞系(有P53基因正常和P53基因缺失两种)的相关研究,探讨这三种药物诱导HCT116细胞系凋亡与P53基因是否相关以及其作用机制。 或许通过继续对奈非那韦以及其他PIs抗肿瘤机制的深入研究,以及通过将其与现有的抗肿瘤药物和或放疗联合应用,可能会针对某些肿瘤起到意想不到的治疗和预防效果[37,38,39,40,41]。 此外,对蛋白酶抑制剂的深入研究,可能会利于PIs类似物或衍生物制剂的开发,使其得到更充分的发展,从而寻求更多癌症的有效治疗方法。

摘要：HIV蛋白酶抑制剂(PIs)是一类抗HIV药物,其广泛应用大大提高了HIV感染者的生存率并延长了其生存期。近来,人们发现PIs具有抗肿瘤活性,这引发了将PIs重新定位为有效肿瘤化疗药物的想法。本文回顾综述了PIs近年来的研究进展以及其在肿瘤治疗中所起的作用,包括已确定的抗肿瘤机制,完成和正在进行的临床试验,为PIs在今后抗肿瘤方向奠定了基础。