卡莫司汀

卡莫司汀 篇1

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

SHZ-Ⅲ型循环水真空泵(上海亚荣生化仪器厂);0.15μm微孔滤膜(上海医药工业研究院);探头式超声仪(德国Sonifter公司);Zetasizer激光粒度分析仪(英国马尔文公司);H27000型透射电镜(日本Hitachi公司);P680高效液相色谱仪(美国DIONEX公司);卡莫司汀对照品(卡莫司汀原料,含量99.1%,中南大学,批号:20060922);卡莫司汀注射液(河北磁州制药厂,批号:20060815);二棕榈酸磷脂酰胆碱,单棕榈酸磷脂酰胆碱,聚乙二醇-2000-二硬脂酸磷脂酰乙醇胺交连物(DSPE-PEG2000),美国avanti polar lipids inc。葡聚糖凝胶G-50(上海伯奥生物科技有限公司)。其它试剂为色谱纯或分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 卡莫司汀长循环热敏脂质体的制备

按比例定量称取二棕榈酸磷脂酰胆碱、单棕榈酸磷脂酰胆碱、胆固醇、卡莫司汀、DSPE-PEG2000加入乙醚10m L,于45℃恒温水浴中旋转蒸发去除有机溶剂,使磷脂等在烧瓶壁形成均匀类脂薄膜。然后往圆底烧瓶中加入PBS混合缓冲液100 m L,旋转洗膜1 h得到长循环热敏脂质体混悬液。将长循环热敏脂质体混悬液在冰水浴条件下探针式超声适当时间可得到纳米长循环热敏脂质体胶体溶液,室温放置,经0.15μm微孔滤膜过滤除去探头释放的钛颗粒等杂质。按相同比例制备处方中空白长循环热敏脂质体混悬液。

1.2.2

卡莫司汀长循环热敏脂质体理化性能表征粒子大小测定:应用纳米粒径仪测定长循环热敏脂质体的平均粒径和多分散性。透射电镜观察:应用1%磷钼酸负染色制备样品,于透射电镜下观测并照相。

1.2.3 高效液相色谱法(HPLC)

检测卡莫司汀长循环热敏脂质体的包封率与含量色谱条件:色谱柱:Kromasil C18(250 mm×4.6 mm,5μm);流动相:甲醇-水(85∶15);流速:1.0 m L/min;检测波长:240 nm;柱温:25℃;进样量:20μL。

卡莫司汀长循环热敏脂质体的含量测定:精密称取卡莫司汀长循环热敏脂质体适量(约相当于卡莫司汀50 mg)置50 m L量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过。精密量取续滤液2 m L,置50 m L瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀。精密称取卡莫司汀对照品50 mg,置50 m L瓶中,加甲醇适量使溶解,并稀释至刻度,摇匀,精密量取2 m L,置50 m L瓶中,加流动相稀释至刻度,摇匀。按照上述方法测定,用外标法计算样品中卡莫司汀的含量。

采用Sephadex G-50柱色谱法测定包封率:精密量取卡莫司汀长循环热敏脂质体混悬液0.5 m L,置于Sephadex G-50柱,PBS洗脱,收集游离卡莫司汀,以甲醇定容至25 m L,取20μL进样分析,计算游离CCNU量(W游)。另取卡莫司汀长循环热敏脂质体混悬液0.5 m L,用甲醇溶解稀释定容至25 m L,进样分析,计算总药量(W总)。包封率计算方法如下:包封率=(1-W游/W总)×100%。载药量(Loading)(%)=(Wt-Wi)/Wc×100%,其中Wt为长循环热敏脂质体胶体溶液中药物量,Wi为溶液中游离药物量,Wc为载体材料量。

脂质体的稳定性初步考察:将制备的卡莫司汀长循环热敏脂质体冻干充氮气密封,于4℃放置3个月,观察产品外观并分别在1、2、3个月取样,用凝胶柱层析法除去游离药物,测定制剂中药物含量,按下式计算贮存过程中药物的渗漏率P。P=(C0-C)/C0×100%,其中C0、C分别为新鲜制备时和贮存一定时间后药物的含量。结果表明,样品放置3个月后,仍为白色粉末。药物渗漏率小于5%,表明该制剂在上述试验条件下稳定。

2 结果与讨论

2.1 长循环热敏脂质体制备方法及其影响因素

应用薄膜分散法制备长循环热敏脂质体时首先在圆底烧瓶壁形成均匀的磷脂薄膜,水合后则形成乳白色不透明混悬液。应用探针式超声法,输出功率为40 W,上述含泊洛沙姆的长循环热敏脂质体只需2 min即可将粒径减少到100 nm以下,而制备大小相近仅含磷脂的普通纳米脂质体则需超声20min。

2.2 透射电镜观察结果

图1为卡莫司汀长循环热敏脂质体的透射电镜图。长循环热敏脂质体呈球形,与普通脂质体形态无显明差异。

2.3 粒径测定结果

经薄膜超声法制备得到卡莫司汀长循环热敏脂质体的平均粒径为108.6 nm,多分散性指数为0.553。见图2。

2.4 加样回收率试验

精密量取已知含量的卡莫司汀长循环热敏脂质体适量,加入卡莫司汀对照品15,25,35 mg,进行加样回收率试验,结果见附表。

2.5 卡莫司汀含量及包封率测定结果

按外标法计算卡莫司汀长循环热敏脂质体中卡莫司汀的含量,其标示量分别为96.7%,96.2%,99.3%;卡莫司汀长循环热敏脂质体中药物含量为(0.998±0.082)mg/m L,载药量为(38.92±0.11)%,包封率达到(97.26±0.12)%,符合药典要求(>80%)。

3 讨论

热敏脂质体的热靶向性是一种主动靶向:通过改变脂质双层的磷脂组成,使脂质体在某些特定的物理条件下不稳定,从而在特定的靶器官释放出所携带药物而达到靶向给药,其热靶向效果很明显。脂质体制备方法有逆相蒸发法、薄膜分散法、冷冻干燥法、冻融法、熔融法、复乳法、预脂质体法、超声波分散法、摇法、非手摇法、乙醇注入法、乙醚注入法、表面活性剂处理法等[1,2,3,4,5,5],由于卡莫司汀脂溶性好,故本实验采用薄膜分散法加超声法制备长循环热敏脂质体。在包封率测定中,通常应用透析法、葡聚糖凝胶层析法和超速离心法等将长循环热敏脂质体与游离药物分离,测定长循环热敏脂质体混悬液中总药量和未包入长循环脂质体中的药物量。笔者采用常用的葡聚糖凝胶层析法进行分离。采用HPLC法检测包封率,结果表明卡莫司汀长循环热敏脂质体包封率很高,达97%以上,提示磷脂双分子层可显著增溶卡莫司汀,与卡莫司汀注射液相比,可以相对增加在脑中的局部浓度,提高抗肿瘤效果,并且相对降低其他脏器的浓度,减少毒副作用。

摘要：目的研究卡莫司汀长循环热敏脂质体的制备及表征。方法采用薄膜分散并超声法制备卡莫司汀长循环热敏脂质体,采用透射电镜、激光粒度分析仪检测其形态与粒径分布,采用凝胶柱层析法分离脂质体与游离药物,采用高效液相色谱法研究其含量与包封率。结果卡莫司汀长循环热敏脂质体粒径约100nm左右,包封率达97%以上。结论成功制备了卡莫司汀长循环热敏脂质体。

关键词：卡莫司汀,长循环热敏脂质体,高效液相色谱

参考文献

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卡莫司汀机制研究 篇2

卡莫司汀于属于烷化剂类抗肿瘤药物，能有效的抑制肿瘤细胞的生长与增殖，根据卡莫司汀（BCNU）的大量国内外相关文献，对该药的作用机制研究为指导临床用药提供依据。

BCNU（卡莫司汀）是亚硝基脲类药物的一种，水解后形成具有活性的代谢产物，这些代谢产物可以引起DNA和RNA的烷基化及螺旋链发生交联。用于治疗某些肿瘤性疾病。其分子式为1，3-双（2-氯乙基）-1-亚硝基脲。其可被冻干成浅黄色薄片或凝结块，分子量为214.06。极易溶于乙醇和脂类，不易溶于水。按说明书所叙述配制注射液后进行静脉灌注给药。机制研究如下。

一离体

1）氯乙基亚硝基脲已广泛用于治疗人和试验性动物肿瘤。早期观察到用亚硝基脲类药物，例如BCNU，治疗后同源移植肿瘤小鼠的生存率 >90%，而且该类药物可以对抗相同肿瘤的并发。有人观察了BCNU引起该作用的机制。用BCNU进行肿瘤细胞的在体和离体的靶向治疗研究，用直接细胞毒作用分析方法来分析细胞对巨噬细胞介导的细胞毒性作用的易感性增强的情况，或用抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用分析来分析他们对巨噬细胞介导的细胞毒性作用易感性增加情况。相反，由细胞毒性T淋巴细胞（CTL）、自然杀伤细胞（NK）、或淋巴因子激活 性杀伤细胞（LAK）引起的抗肿瘤细胞毒性作用并没有在BCNU靶向治疗后有所改变。还对在体条件下BCNU对不同细胞毒性效应细胞的直接研究。通过对BCNU处理肿瘤耐受小鼠的巨噬细胞、NK、LAK和CTL活性进行筛查，目的是了解离体条件下对抗未处理肿瘤细胞的细胞毒性作用能力。与对照组相比较，BCNU治疗组中肿瘤特异性CTL和LAK細胞活性增强，而NK细胞和巨噬细胞的细胞毒性作用没有改变。实验结果证实抗肿瘤药物BCNU不仅仅可以增强抗肿瘤免疫作用，还可以选择性的作用于不同的效应细胞，引导整体增强抗肿瘤 免疫作用，使同源性肿瘤得到快速治愈。

2）DTI-015（BCNU的100%乙醇溶液）的肿瘤内给药利用有机溶剂加速药液灌注以进行肿瘤治疗。RIF-1肿瘤或是单独使用乙醇或0.05～1.0mgDTI-015或静脉注射0.5mg BCNU进行肿瘤内注射治疗。单独用乙醇或静脉注射0.5mg GCNU都不会明显的产生肿瘤生长延迟作用。相反，DTI-015肿瘤内注射则可在每个剂量组都产生明显的抑制肿瘤生长的作用（P < 0.05 至 P< 0.001）。我们已经定量测定了0.5mg DTI-015肿瘤内注射或腹腔注射0.5mg BCNU后RIF-1瘤内N7-（2-羟乙基）鸟嘌呤（N7-HOEtG）的含量。未加处理因素的对照组、腹腔注射BCNU的治疗组N7-HOEtG（mmol/mol DNA）的水平为<或=0.08，DTI-015肿瘤内注射N7-HOEtG的水平为13.1 5.6。RIF-1瘤内注射DTI-015后N7-HOEtG水平是腹腔注射BCNU后N7-HOEtG水平的164倍。这些研究证明DTI-015瘤内注射可使肿瘤内DNA加合物水平迅速升高，与腹腔内注射BCNU相比对肿瘤生长的抑制作用明显增强。

二在体

1）亚硝脲类药物-双氯乙亚硝脲[1，3-bis（2-choloroethyl）-1-nitrosourea，BCNU]是临床上一类重要的抗肿瘤药物，它们在生物体内释放出活泼的烷化基团，造成DNA鸟嘌呤第6位氧原子的烷基化，进而引起DNA链间交联，导致细胞死亡。细胞内的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（O-methylguanine-DNA methytransferase， O6-MT）能够特异地修复上述损伤，是决定肿瘤细胞对亚硝脲类药物是否敏感的关键因素。

2）卡氮芥是氮芥类抗肿瘤药。颈内动脉灌注卡氮芥是胶质瘤化疗较为理想的给药途径，但也常导致眼及脑损害。卡氮芥与DNA具有较强的亲和性，与DNA相结合，生成具有活性的自由基，使DNA链断裂而发挥抗瘤作用，同时也耗尽了体内的抗氧化系统，从而损害了正常脑组织。许多实验结果表明，体内注入抗氧剂，由于肿瘤组织内缺乏诱导酶及抗氧剂水平低于正常，不仅不会激化肿瘤的生长，而且在一定条件下能阻止其生长，所以化疗的同时应用抗氧剂是有效的辅助治疗措施。脑组织内含有大量的磷脂、侧链为多不饱和脂肪酸（PUFA），极易受到过氧化的中间产物自由基与最终分解产物丙二醛对膜结构产生严重的损害，影响膜的功能，使线粒体等细胞器结构与功能改变，造成脑的损害。脑组织为代谢最活跃的器官，卡氮芥阻碍了核酸的翻译、转录过程，使蛋白合成减少，丙二醛与酶结合成Schiff碱，使酶的活性丧失，同时膜的脆性增加，线粒体膨胀，溶解，微粒体膜上存在嘌呤氧化酶和NADPH，并有铁还原剂，为微粒体脂质过氧化提供了强有力的催化系统，导致多聚核糖体的解聚、脱落，抑制了蛋白质的合成。

3）卡氮芥（BCNU）与苯丁酸钠（SPB）联合治疗移植于裸小鼠皮下的低分化人脑胶质瘤，观察移植瘤体积变化、病理学形态、细胞增殖周期时相、分化抗原表达和细胞凋亡情况等指标。结果：BCNU与SPB联合给药组的疗效明显优于任何一种单独给药组，表现为肿瘤体积增加缓慢，光镜下细胞密集程度降低，间质增加，出现类星形的多角形细胞，G0/G1期细胞比例增加，胶质纤维酸性蛋白表达上调，凋亡细胞增多。结论：BCNU与SPB联合使用可显著抑制胶质瘤细胞的增殖，并促进其向良性方向分化。