钙蛋白酶-5基因 篇1
1 资料与方法
1.1 研究对象
选择2008年11月至2009年4月在贵阳医学院附属医院就诊的PCOS不孕患者61例为PCOS组,诊断标准依据2003年鹿特丹标准[2]及2006年PCOS重庆共识。其中月经稀发或闭经59例(96.7%),多囊卵巢表现57例(93.4%),血清总睾酮(T)>2.6 nmol/L 18例(29.5%),多毛21例(34.4%),痤疮18例(29.5%),BMI>25 kg/m2 22例(36.1%),中心性肥胖(女性WHR>0.85)39例(69.9%),空腹INS(≥24 mU/L)8例(13.1%)。另选择同期因单纯输卵管因素或男性因素不育在我院就诊的70例不孕患者为对照组。两组患者近3个月未使用激素类药物,并排除内分泌、高血压等疾病。两组一般资料的比较见表1。
1.2 方法
1.2.1 Calpain-5基因多态性分析
采用AS-PCR方法。
1.2.1.1 引物设计
根据NCBI数据库获得DNA序列,引物设计参照文献[3]中Calpain-5基因4个位点用Primer 3在线引物设计软件(http://primer3.wi.mit.edu/)设计,见表2。
1.2.1.2 反应体系
扩增总体系为25 μl,包括10×buffer 2.5 μl,1.5mmol/L Mg2+ ,2.5 mmol/L dNTPs,特异性上游引物1/特异性上游引物2、通用下游引物各1 pmol/L,高效Taq DNA酶1.5 U,模板DNA0.5 μl(150 μg/ml),ddH2O补足25 μl。
1.2.1.3 反应条件
95℃预变性2分钟,94℃变性45秒,温度(rs948976:57℃,rs4945140:57.5℃,rs2233546:57℃,rs2233549:58℃)退火30秒,72℃延伸45秒,30个循环,最后经72℃延伸7分钟后终温度4℃保存。取5 μl扩增产物,在1.5%琼脂糖凝胶(含溴化乙啶0.5 μg/ml)中电泳,紫外灯下观察结果,参照DNA MarkⅠ,根据电泳条带判定Calpain-5基因型。
1.2.2 基因测序验证
使用ABI310全自动基因测序仪做PCR产物的基因测序验证。
1.2.3 统计学方法
采用SPSS 10.0统计软件进行数据的统计处理。计量资料的比较采用独立样本t检验,计数资料采用χ2检验。Calpain-5基因单核苷酸多态性位点连锁不平衡分析及单倍体型构建、单倍体型频率分布在两组间的比较运用SHEsis软件统计。当D′值=1时,2个位点之间没有重组发生,即2个位点处于“完全连锁不平衡”;当D′为0.5～1,表示存在连锁不平衡,程度较高;D′为负值,表明2位点处于连锁不稳定状态或某种选择劣势。r2 的取值范围在0～1,其数值表示1个位点可反映另1位点信息量的程度,在某种程度上可看作D′的补充,r2=1 称为连锁不平衡,这时只观察1个标记即可提供另1个标记的全部信息;r2>1/3,认为是“最小的有用连锁不平衡”值[4]。
2 结 果
2.1 Calpain-5基因4个位点基因型及等位基因的检测
Calpain-5基因rs948976存在3种基因(见图1):AA型纯合子、AG型杂合子和GG型纯合子,等位基因包括A和G,目的条带152 bp。
(MⅠ:DNA MarkⅠ;1样本两孔AA型;2样本两孔GG型;3样本两孔AG型)
rs4945140存在2种基因(见图2):AG型杂合子和GG型纯合子,等位基因包括A和G,目的条带218 bp。rs2233546存在3种基因(见图3):CC型纯合子、CT型杂合子和TT型纯合子,等位基因包括C和T,目的条带228 bp。rs2233549存在2种基因(见图4):AG型杂合子、GG型纯合子,等位基因包括A和G,目的条带157 bp。
(MⅠ:DNA MarkⅠ;1样本两孔无扩增型;2样本两孔AG型;3样本两孔GG型)
(MⅠ:DNA MarkⅠ;1样本两孔CC型;2样本两孔CT型;3样本两孔TT型)
(MⅠ:DNA MarkⅠ;1样本两孔无扩增型;2样本两孔GG型;3样本两孔AG型)
2.2 Calpain-5基因4个位点基因型及等位基因频率分布在两组间的比较
2.2.1 rs948976位点
rs948976检测出的AA基因型数量较少,将AA 型与AG 型合并,AA/AG和GG基因型频率在两组间分布比较,差异有统计学意义(χ2=4.970 ,P<0.05)。其中PCOS组AA/AG基因型频率高于对照组(OR=3.56,95%CI 1.16～10.88),对照组GG基因型频率高于PCOS组(OR=0.28,95%CI0.09～0.86)。两组间等位基因A、G频率分布比较,差异无统计学意义(χ2=0.740,P>0.05)。见表3。
2.2.2 rs4945140位点
rs4945140检测出的GG基因型数量较少,故两组间基因型频率比较未进行统计学检验,其等位基因在两组间的分布比较,差异无统计学意义(χ2=0.013,P>0.05)。见表3。
2.2.3 rs2233546位点
rs2233546的TT基因型数量较少,将CT 型与TT 型合并,CC及CT/TT基因型在两组间的分布比较,差异有统计学意义(χ2=17.270,P<0.05),其中PCOS组CT/TT基因型频率高于对照组(OR=8.42,95%CI 3.09～22.92),而对照组CC基因型频率高于PCOS组(OR=0.12,95%CI 0.04～0.33)。两组间等位基因频率比较,差异有统计学意义(χ2=5.830,P<0.05)。等位基因T在PCOS组的分布频率高于对照组(OR=1.85,95%CI 1.12～3.04,P<0.05);而对照组的等位基因C的分布频率高于PCOS组(OR=0.54,95%CI 0.1～0.97,P<0.05),见表3。
2.2.4 rs2233549位点
rs2233549检测出的基因型AG、GG在两组间分布比较,差异有统计学意义(χ2=7.430,P<0.05),但是等位基因在两组间的分布差异无统计学意义(χ2=1.110,P>0.05),见表3。
2.3 Calpain-5基因4个位点连锁不平衡及单倍体型频率分布比较
运用SHEsis软件,配对连锁不平衡检验表明,4个位点均存在连锁不平衡,见表4。4种位点单倍体型在PCOS组和对照组间的频率总体分布差异有统计学意义(P<0.01),见表5。
注:横排代表D′,纵排代表r2
注:SHEsis软件统计单倍体型频率<0.03忽略,计算过程中PCOS组和对照组单倍体型均有丢失。
3 讨 论
Calpain-5基因来自钙蛋白酶基因超家族,位于染色体11q.14,全长59192 bp,含有14个外显子和13个内含子,广泛表达于体内各种组织[5,6],可调节多种细胞功能[7],Patel等[8]发现Calpains与脂肪细胞的分化相关,Sáez等[9]发现Calpain-5与过氧化物酶增殖物激活受体δ (PPARδ)基因在体内相互影响可能会降低发生肥胖的风险。人类Calpain-5基因是线虫tra3(性别转化基因)的直系同源基因,tra3可调节雌雄共体生物的生殖细胞向雄性化发育[10];位于Calpain-5基因内含子3内的嗅觉标记蛋白OMP基因,其功能障碍与不孕症的某些类型(kallmanns syndrome)相关。
3.1 Calpain-5基因单核苷酸多态性与PCOS遗传易感性之间的关系
本实验中发现,Calpain-5基因位点rs2233546的单核苷酸多态性与PCOS的易感性有关,等位基因T可能是PCOS易感的一个危险因素,可能会使PCOS的患病风险增加,碱基T的表型可能易感PCOS,携带CT/TT基因型的人可能易感PCOS,其发生PCOS的风险可能是CC基因型的8.42倍,而CC基因型可能是免受PCOS遗传易感的保护因素。在位点rs948976上,提示携带AG/AA基因型的人可能易感PCOS,其发生PCOS的风险可能是GG基因型的3.56倍,而GG基因型可能是免受PCOS遗传易感的保护因素,等位基因A和G在两组间的分布差异无统计学意义(P>0.05)。位点rs4945140的单核苷酸多态性与PCOS的易感性无关,位点rs2233549基因型AG可能与PCOS的易感有关,基因型GG可能与免受PCOS遗传易感的保护因素有关。对于Calpain-5基因中位点rs948976等位基因、rs2233549等位基因及rs4945140基因型和等位基因在两组间分布比较,差异均无统计学意义,可能是样本量不够或统计及遗传分析方法选择的不恰当而未能检出,或该位点单个核苷酸的变异在患者及健康人群中的分布本来就不存在差异,或各位点的基因的协同作用可能会增加疾病的易感性等有关。
3.2 Calpain-5基因4个位点连锁不平衡及单倍体型频率分布比较的分析
相对于遗传易感因素来说,每个多态位点的存在对于疾病的发生发展并不只是起到一个孤立的作用,其相互之间也可能存在一定的内在关联与作用,单倍体型则是这种遗传关联的体现,所以对于单倍体型的研究能揭示多个单核苷酸多态性与疾病易感的关联。研究Calpain-5基因多个位点变异构成的单倍体和PCOS的相关意义可能会更大一些。本实验中配对连锁不平衡检验表明,Calpain-5基因位点rs948976、rs4945140、rs2233546、rs2233549均存在连锁不平衡,4种位点单倍体型在两组间的频率总体分布差异有统计学意义(P<0.05),提示Calpain-5基因位点rs948976、rs4945140、rs2233546、rs2233549单倍体型与PCOS的易感性有关。其中单倍体型AACG、GACG、AGCG、GATG在两组间频率分布差异有统计学意义(P<0.05),携带AACG、AGCG、GATG单倍体型的人可能易感PCOS的风险增加,单倍体型GACG可能是个保护因素。Gonzalez等[3]以西班牙人种为研究对象,分析了148例PCOS患者和606例健康妇女Calpain-5基因4个多态位点rs948976、rs4945140、rs2233546、rs2233549的多态性,单倍体型分布在两组间有明显差异,其中单倍体GGCA及GGTG在PCOS患者中显著升高(P=0.009;P=0.001),此与本研究结果不一致,原因可能是种族、地域、实验的方法不尽相同,且其选择的样本较大有关,本实验今后还需要进一步扩大样本例数,并结合其他地域人群资料以及环境因素等来进行更深入的研究予以验证。
PCOS属于一种多基因遗传疾病,其发生机制涉及多个基因,而每个基因可能只是直接或间接通过对中间性状的影响促成疾病的发生,而并不仅是单一基因位点的突变所致,本实验所检测的基因可能只是诸多基因中的一个,对PCOS的发生发展可能只起到微效作用,要明确Calpain5基因对PCOS易感性的主次效、强弱度的影响,还需要进一步扩大样本例数,并结合不同种族、不同地域人群资料以及环境因素,并采用更先进的方法进行更深入的研究来验证。此外,本文所获得的Calpain5基因4种位点多态性资料,可为Calpain5基因SNP数据库提供一定的基础资料。
摘要：目的:探讨钙蛋白酶-5(Calpain-5)基因单核苷酸多态性与多囊卵巢综合征(PCOS)的关系。方法:运用等位基因特异PCR(allele-specificPCR,AS-PCR),分析61例PCOS和70例非PCOS不孕患者的Calpain-5基因4个位点(rs948976、rs4945140、rs2233546和rs2233549)的单核苷酸多态性。结果:两组间位点rs948976和位点rs2233549基因型频率比较,差异有统计学意义(χ2=4.970;χ2=7.430,P<0.05),位点rs2233546基因型频率和等位基因频率比较,差异均有统计学意义(χ2=17.270;χ2=5.830,P<0.05);位点rs4945140基因型频率和等位基因频率差异无统计学意义(P>0.05)。4个位点之间均存在连锁不平衡,单倍体型AACG、GACG、AGCG、GATG在两组间频率分布比较,差异均有统计学意义(AACG、AGCG、GATG的OR>1,P<0.01;GACG的OR<1,P<0.01)。结论:Calpain-5基因位点rs948976、rs2233546和rs2233549单核苷酸多态性与PCOS的易感性有关;单倍体型AACG、AGCG、GATG与PCOS的易感性可能有关,单倍体GACG可能是保护因素。
关键词：钙蛋白酶-5基因,多囊卵巢综合征,单核苷酸多态性
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钙蛋白酶-5基因 篇2
关键词 巴西橡胶树 ；钙调蛋白 ；基因克隆 ；基因家族 ；表达分析
中图分类号 S794.1 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.07.009
在植物生长发育的过程中，钙离子作为第二信使扮演着至关重要的角色。钙调蛋白（Calmodulin，CaM）是一类存在于动植物真核细胞内和钙离子相结合的小分子蛋白[1]，也是生物细胞内功能和分布最广泛的高度保守的蛋白之一[2]。钙调蛋白有4个Ca+结合域，多数CaM氨基酸序列的长度为148个，细胞内钙离子浓度升高，使钙调蛋白的钙离子结合位點被占据，因而改变了其构象，并促进其与细胞内靶酶的结合，由此改变细胞内的代谢活动。由于钙调蛋白重要的调控功能引起了人们的重视，钙调蛋白基因在动物[3-4]、真菌[5]和原生动物[6]中都已被分离和克隆。在植物界，迄今为止已成功克隆了拟南芥[7]、水稻[8]、大麦[9]、苜蓿[10]、香蕉[11]等物种的钙调蛋白基因，并对其进化和表达进行了分析。在橡胶树中，仅有陈鑫等[12]利用RACE克隆了一个钙调蛋白基因HbCAM1，并利用RT-PCR技术对该基因在不同组织和乙烯利处理胶乳中的表达进行了初步分析。随着橡胶树基因组测序的完成，使人们能够对整个橡胶树钙调蛋白基因家族进行全面系统的分析。本研究从橡胶树转录组和基因组数据库中搜索并克隆得到7个钙调蛋白基因，并从基因结构、系统进化和表达模式几方面对这些家族成员进行了全面系统的分析。研究结果将有助于深入了解钙调蛋白基因家族成员在橡胶树生长发育和胁迫应答调控方面的重要功能。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料
本实验室Solexa测序所用的材料是巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）热研7-33-97，其中胶乳、树皮、树叶、种子、雌花和雄花均来自中国热带农业科学院试验场三队的正常割胶橡胶树（开割2 a以上），根来自于中国热带农业科学院橡胶研究所种质资源圃华于伟老师赠送的热研7-33-9 组培苗；不同发育时期的橡胶树叶片来自于中国热带农业科学院橡胶所种质资源圃，为一年生的热研7-33-97嫁接苗；乙烯利处理的材料来自于海南省儋州市中国热带农业科学院试验场三队，品系为热研7-33-97，正常开割树（3天1刀，不涂乙烯利刺激），用1.5%乙烯利在不同时间处理橡胶树，相应4个时间点处理为0、3、12和24 h。
1.1.2 菌株与试剂
反转录试剂盒购自Fementas公司；pMD18-T载体和Taq DNA聚合酶均购自Takara公司；引物合成和测序由华大生物技术有限公司完成；DNA凝胶回收试剂盒购自Axygen公司；其它生化试剂和常规试剂均为进口或国产分析纯试剂。
1.2 方法
1.2.1 不同组织RNA的提取与cDNA合成
橡胶树胶乳RNA的提取参照Tang等[13]的方法；除胶乳以外其他组织的RNA提取方法参照Kiefer等[14]的方法；cDNA第一条链的合成采用反转录试剂盒，操作步骤按照Fementas公司产品说明书进行。
1.2.2 cDNA全长和基因组序列的克隆
利用拟南芥和杨树的钙调蛋白氨基酸序列，通过本地BLAST搜索本实验室EST数据库，得到7个钙调蛋白基因的cDNA片段。然后设计特异性引物进行PCR扩增（表1），具体反应体系如下：模板（胶乳cDNA）0.5 μL、10×PCR Buffer 2 μL、Taq plus DNA Polymerase（5 U/L） 0.3 μL、dNTPs（2.5 mmol/L） 1.6 μL、上下游引物各1 μL、ddH2O 13.6 μL，共20 μL体系。反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸60 s，35个循环；72℃延伸10 min。扩增完成后，用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的片段，并连接到pMD18-T载体上，最后送公司测序。
1.2.3 生物信息学分析
利用NCBI在线软件ORF finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）进行ORF阅读框预测，利用生物软件DNAMAN对橡胶树和拟南芥的CaM氨基酸序列进行多序列比对。利用在线软件GSDS2.0（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）分析钙调蛋白基因的外显子/内含子组织结构。利用MEGA 6.0软件构建系统进化树，采用Neighbor-Joining方法进行分子系统学分析，并进行1 000次bootstrap统计学检验。
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1.2.4 基因的表达模式分析
利用高通量测序数据[15]（Solexa转录组测序数据）对橡胶树钙调蛋白基因在不同组织、不同叶片发育时期和乙烯利处理下的表达进行分析。具体分析流程包括：对原始数据去除低质量序列，利用程序RSEM进行表达分析[16]和数据处理作图3个部分，其中前2步在本地服务器完成。
2 结果与分析
2.1 橡胶树钙调蛋白基因的克隆与序列分析
本研究以拟南芥和杨树钙调蛋白氨基酸序列为探针，利用tblastn搜索本实验室的EST数据库，分离并克隆得到了7个橡胶树钙调蛋白基因的cDNA序列，命名为HbCaM1-7（对应序列的NCBI登陆号为：HbCaM1，AJJZ010938311.1；HbCaM2，AJJZ010269732.1；HbCaM3，AJJZ010929368.1；HbCaM4，AJJZ010665409.1；HbCaM5，AJJZ010127638.1；HbCaM6，AJJZ010231096.1；HbCaM7，AJJZ010372997.1）。通过NCBI在线软件CDD分析，结果发现这7个基因均具有钙调蛋白基因所特有的保守结构域（图1）。经序列分析结果发现，HbCaM1-7的CDS序列均为450 bp，编码149个氨基酸，分子量为16.8 ku，等电点为3.95。其中，HbCaM1-6之间氨基酸同源性为100%，HbCaM7与其他成员之间的氨基酸同源性为98%，各成员之间CDS序列同源性为80.4%～96.4%。
2.2 基因结构和进化分析
利用在线软件GSDS 2.0，对橡胶树钙调蛋白基因的外显子/内含子组织结构进行分析（图2）。分析结果发现，各家族成员在内含子数目和相对位置都非常一致，而内含子的長度却存在一定的差异。为了比较橡胶树和其他植物钙调蛋白在进化上的相互关系，选取了杨树（Populus trichocarpa， Pt）、拟南芥（Arabidopsis thaliana，At）、水稻（Oryza sativa，Os）、蓖麻（Ricicus communis，Rc）及7条橡胶树（Hevea brasiliensis，Hb）钙调蛋白氨基酸序列，利用软件MEGA 6.0采用Neighbor-Joining法构建进化树，并进行1 000次bootstrap统计学检验（图3）。从图3中可看出，很多家族成员聚在一条直线上，说明这些成员之间的亲缘关系比较近，这和植物钙调蛋白氨基酸序列的高度保守性是一致的，例如橡胶树中HbCaM1-6虽然核苷酸序列存在差异，但氨基酸序列却是完全一致的，类似的还有拟南芥中AtCaM2-5、杨树中的PtCaM2-4等。植物钙调蛋白在进化上的保守性也说明其在功能上的重要性。
2.3 橡胶树钙调蛋白基因家族成员的表达分析
利用本实验室Solexa高通量测序数据对7个橡胶树钙调蛋白基因在不同组织、不同叶片发育时期和乙烯利处理后不同时间点的表达情况进行分析。其中不同组织包括胶乳、树皮、树叶、根、种子、雌花和雄花。结果表明，虽然7个家族成员在序列上具有较高的同源性，但在表达方面却存在着一定的差异（图4）。各家族成员在所检测的各组织中普遍表达，除了HbCaM3在种子中表达丰度最高，其他成员均是在胶乳中表达丰度最高，而HbCaM7在各组织中的表达丰度都很低，这说明橡胶树钙调蛋白基因在胶乳信号传导方面可能发挥着重要作用。
乙烯刺激对橡胶树胶乳中基因表达的影响结果见图5。由图5可知，乙烯利刺激3 h后，橡胶树钙调蛋白各家族成员的表达均有一定的上升趋势，其中HbCaM4和HbCaM6的变化趋势相对更加明显。据此推测，橡胶树钙调蛋白基因参与了橡胶树胶乳乙烯信号应答相关通路。橡胶树钙调蛋白基因家族成员在叶片发育过程中的表达情况见图 6，除了HbCaM7基因外，其他各成员在叶片发育过程中的表达均呈下降趋势，在稳定期的表达明显低于其他各时期。这说明橡胶树钙调蛋白基因可能参与了橡胶树叶片生长发育相关的调控。
3 讨论与结论
钙调蛋白在调控植物生长发育和参与植物逆境胁迫应答等方面具有重要作用。通过对拟南芥钙调蛋白基因家族的研究发现，不同家族成员在拟南芥生长发育的不同阶段具有不同的表达丰度，一叶期AtCAM4表达丰度最高，二叶期AtCAM2表达丰度最高，而到四叶期AtCAM1、AtCAM4、AtCAM5和AtCAM7具有较高的表达丰度[17]。在胁迫应答方面，研究结果发现，拟南芥大部分钙调蛋白基因家族成员都参与了胁迫和激素刺激相关应答反应[18]。程晓培等[19]对逆境胁迫下MaCAM的表达进行分析，结果发现MaCAM明显盐胁迫、干旱和低温诱导。在水稻中，通过分析基因家族成员在不同组织中的表达，结果发现，各家族成员在叶片和花中的表达明显高于根和种子等其他组织[20]。本研究结果发现，除了HbCaM3在种子中表达丰度最高，其他各成员均在胶乳中表达丰度最高，并且在乙烯利刺激后大部分成员的表达都有一定的上升趋势，这说明橡胶树钙调蛋白参与了橡胶树乳管逆境胁迫应答相关信号通路。另外，通过研究橡胶树钙调蛋白各家族成员在叶片发育过程中的表达，结果发现，所有成员在叶片发育过程中的表达均呈下降趋势，在稳定期叶片中的表达最低，这说明钙调蛋白参与橡胶树叶片生长发育相关的信号调控，并且更多在代谢较活跃的组织中表达。本研究从基因结构、系统进化和表达模式几方面对橡胶树钙调蛋白各家族成员进行了系统的分析。研究结果将有助于深入了解钙调蛋白基因家族成员在橡胶树生长发育和胁迫应答等方面的重要功能。
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