再生细胞 篇1
关键词：毛乳头细胞,隆突部细胞,毛囊
组织工程学的概念于1987 年被正式提出[1], 近年来组织工程技术越来越多的应用于临床。其中, 组织工程皮肤取得了可喜的进步并在临床治疗中表现出了良好的效果。毛囊作为皮肤附属器官, 具有重要的生物学功能, 也成为组织工程学的研究热点。
毛囊的发生发育与牙齿有很多相似之处, 可以作为研究上皮间充质相互作用的模型。毛囊的形成、生长发育、毛发生长以及毛囊周期调控都是毛囊上皮细胞和真皮细胞相互作用的结果[2], 利用组织工程学方法构建毛囊同样离不开上皮间充质的相互作用。
最近, 越来越多的研究表明, 毛囊中含有多向分化能力的表皮干细胞, 而毛囊的隆突部就存在这种细胞[3]。Cotsarelis等[4]报道标记保留细胞仅在小鼠毛囊隆突部发现, 存在于隆突部的角质细胞具有相对未分化和细胞周期缓慢等特点。Taylor等[5]用双标法追踪毛囊干细胞, 当用BrdU标记小鼠全部表皮细胞时, 经8周后在隆突部仍可见BrdU标记细胞。上述结果表明毛囊干细胞很可能定位在毛囊隆突部。曾有人认为干细胞存在于毛球部, 后来的实验证实, 将整个毛球部去除以后, 毛囊仍有可能再生[6]。
在毛囊的间充质细胞中, 毛乳头细胞 (dermal papilla cells, DPCs) 占有着重要的地位, 它可以调控毛囊的发育生长和毛囊周期, 还能诱导毛囊形成和促进毛囊再生[7]。在体外传代培养的毛乳头细胞仍保持这种诱导能力。移植人毛囊毛乳头到横断的裸鼠触须毛囊后, 其诱导毛发生长的能力仍然存在, 与毛囊上皮接触的毛乳头可产生有形成新毛发纤维能力的毛囊末端球部[8]。毛乳头还控制着毛母质细胞数量和毛发粗细[9], 毛乳头的大小决定着毛囊的大小, 以上研究都证明了毛乳头细胞在毛囊生物现象中的重要性。
本研究试图从成熟毛囊中获取隆突部细胞和毛乳头细胞, 并构建出含有毛囊表皮干细胞和毛乳头细胞的复合细胞团, 而后探索其于体内形成毛囊的可能性。
1 材料和方法
1.1 实验动物和主要材料
7 d龄SD大鼠子鼠, 2 月龄SD大鼠 (均由第四军医大学实验动物中心提供) , 胎牛血清 (FBS, 杭州四季青应用研究所) ;DMEM培养基, Dispase酶, 胶原酶, K- SFM培养基 (均购自美国Gbico公司) , 纤维蛋白胶 (广州倍绣公司) , I型胶原, 六孔板。
1.2 实验方法
1.2.1 毛乳头细胞的培养和鉴定
选取7 d龄SD子鼠, 处死后于无菌条件下剪取触须部皮肤, 于体视显微镜下从皮肤真皮侧拔取完整的触须部毛囊。用针头挑开毛球部, 暴露毛乳头组织, 吸管吸取毛乳头组织, 转移至六孔板内, 30 个/孔, 加入10%胎牛血清DMEM培养液, 置于37 ℃、 5% CO2孵箱中培养。待细胞基本爬出后传代, 每隔2 d换液1 次。
取第二代的毛乳头细胞制备细胞爬片, 选择α- SMA作为一抗进行细胞免疫荧光染色。具体步骤如下:取出细胞爬片, PBS清洗后, 95%酒精固定40 min;0.25% TritonX- 100于37 ℃下处理细胞爬片10 min;PBS洗涤3×5 min;羊血清封闭, 37 ℃, 30 min;弃去封闭血清, 勿洗;加一抗, 4 ℃过夜;37 ℃复温1 h; PBS洗3×5 min;加荧光标记的二抗, 37 ℃孵育1 h;PBS洗3×5 min;Hoechst衬染细胞核;PBS充分漂洗, 置于荧光显微镜下观察。
1.2.2 隆突部细胞的培养和鉴定
如上法获取大鼠触须部毛囊, 加入Dispase酶4 ℃过夜。PBS洗2 遍, 用显微镍夹住毛干往表皮侧分离毛干和胶原鞘, 可见外根鞘组织附于毛干上, 取隆突部, 置于6 孔板内, 10根/孔, 盖玻片覆盖组织上, 加入K- SFM培养液, 置于37 ℃、 5% CO2孵箱中培养。待细胞基本爬出后取出盖玻片, 胰酶和EDTA消化传代, 每隔2 d换液1 次。
设计大鼠K15引物, K19引物。K15, 上游:GGGTGCTGCGTCCATTTCCA, 下游:ATCAATGGGCTGCGGAGGGT, 大小为177 bp;K19, 上游:ACCTCCAGCTCGCCATTAGCCT, 下游:ACCCGCATCGTGTCCTCATCCT, 大小191 bp。行PCR实验。
1.2.3 细胞团的制备和体内移植
选取生长良好的第二代隆突部细胞5×106 个消化离心, 纤维蛋白胶包裹, 待用。取生长良好的第二代毛乳头细胞混合I型胶原, 调整浓度为2×107/ml, 在调制好的I型胶原未凝结之前, 将隆突部细胞团埋于150 μl I型胶原中, 置于含DMEM培养液的培养皿中37 ℃孵箱培养24 h。将细胞团移植于大鼠肾被膜下, 2 周后取材制作HE切片并行CK免疫荧光染色, Hoechst衬染胞核。
2 结 果
2.1 毛乳头细胞的分离培养及鉴定
静止培养的毛乳头组织, 7 d后毛乳头细胞基本爬出, 毛乳头细胞呈成纤维细胞样, 放散状生长 (图 1A) 。α- SMA免疫荧光呈阳性表达 (图 1B) 。
A: 毛乳头组织贴壁7 d (×40) ; B: 第二代毛乳头细胞的α- SMA免疫荧光染色 (×100)
A: Primary culture of dermal papilla cells (IPCM×40) ; B: Expression of α- SMA in DPCs (IPCM×100)
2.2 隆突部细胞的分离培养及鉴定
1 周后, 隆突部细胞由组织块内爬出, 呈铺路石状, 细胞状态良好 (图 2) 。PCR实验结果图中177 bp及191 bp处出现亮带, 尤其为K177 bp处 (图 3) , K15及K19表达阳性。
2.3 细胞团移植结果
移植大鼠肾被膜2 周的细胞团组织HE切片中, 可见有上皮细胞环形排列围绕中心角化物质, 形成类似毛囊的结构 (图 4A) 。免疫荧光染色毛囊样结构中有CK阳性组织存在 (图 4B) 。
3 讨 论
本实验成功地从大鼠毛囊中分离了来源于表皮成分和间充质成分的2 种细胞, 并利用这两种细胞于体内异位构建出了毛囊样的结构。
国内有学者证实, 相对于3T3滋养层培养出的隆突部细胞, DK- SFM培养出的隆突部细胞更纯, 且能更好的保持细胞活性[10]。参考这种实验方法, 我们选用组织块原代培养法, 利用K- SFM培养基培养出隆突部细胞。培养出的细胞呈表皮细胞样, 且生长状态良好, K15、K19特征性表达, 表明本实验成功分离并得到了隆突部细胞[11]。同时, 我们利用微解剖的方法获得了毛乳头组织, 保持了毛乳头细胞的纯度, 经传代培养的毛乳头细胞α- SMA免疫组化染色阳性, 符合先前的文献报道, 鉴定了所培养细胞的组织来源[12]。
A: 复合细胞团大鼠肾被膜下移植2 周后 (HE, ×200) , 箭头所指为毛囊样结构; B: 移植2 周后细胞团CK免疫荧光染色 (×200) , 角化组织呈红色荧光
A: Arrow shows a hair follicle like structure (HE, ×200) ; B: CK expression (IPCM, ×200)
对于毛囊再生的条件人们进行过多次探索。Rogers等[13]将从新生小鼠上游离下来的毛囊, 不培养或进行培养后与真皮成纤维细胞混合移植于裸鼠背部, 2～3 周后发现裸鼠背部长出了浓密的毛发。Weinberg等[14]在此基础上进一步对毛发生长时所需的细胞成分进行了研究, 他们发现新鲜的真皮细胞能诱导毛囊芽悬液重建毛囊, 毛囊芽单独移植或与培养过的真皮细胞联合移植虽能构建出皮肤, 但不能产生毛发。而游离的成熟毛囊可以在移植部位产生毛发, 不需要另外的真皮成分。在实验中他们还发现经过培养后的大鼠触须毛乳头细胞仍具有诱导毛发形成的能力。因此认为成熟毛囊本身即含有毛囊形成所需的成分, 而培养过的真皮细胞不能诱导毛囊芽产生毛发可能是因为其缺乏毛乳头细胞所致。
有学者发现将分离的胚胎小鼠皮肤间充质细胞与上皮细胞悬液混合注入裸鼠皮下, 上皮细胞先聚集形成团块, 周围有间充质细胞聚集, 继而细胞经过凋亡、分化, 最终形成毛囊[15]。在Chermnykh的实验中, 亦有毛乳头细胞制成的人工真皮配合角质细胞团, 在体外形成肢芽样结构[16]。根据此实验结果, 本实验将隆突部细胞团埋入毛乳头细胞制成的人工真皮中, 在体内培养后获得毛囊结构。
在实验中, 我们采用了毛囊隆突部的干细胞制作细胞团, 包埋于毛乳头细胞团中, 并移植于大鼠肾被膜下, 探索此种方法重建毛囊的可能性。在体内2 周的细胞团HE切片中, 可见有表皮细胞环形排列, 中央有毛发样的角化物质生成, CK染色标明了角化物的存在, 切片中的这种结构形态与正常的毛囊类似, 且均位于隆突部细胞团与毛乳头细胞团交界及附近, 很有可能是2 种细胞相互作用的结果。肾被膜下是免疫豁免区域, 细胞团异位移植仍能够产生毛囊结构, 说明仅利用2 种细胞即可获得毛囊存在可能。
再生细胞 篇2
关键词：再生丝素蛋白膜,溶失率,消化,细胞培养基质
0引言
丝素蛋白是一种源于蚕丝的天然高分子材料,来源丰富,具有良好 的细胞相 容性、可降解性 和透气透 湿性等优 点[1,2,3]。近年来,其用途已渗透到细胞培养基质、组织工程材料、固定化酶载体和生物传感器等方面[4,5,6,7]。但以丝素蛋白为原料制成的丝素蛋白膜、多孔支架及 微囊等存 在溶失率 高,抵抗酶、酸、碱等能力差的缺陷[8],这是目前限制其作为生物材料直接应用的重要原因。而将丝素蛋白同其它材料共混或通过添加甲醛、戊二醛和环氧化合物等有毒交联剂制出的材料虽然性能可得到改善,但这势必会降低丝素蛋白良好的细胞相容性[9]。因此,迫切需要寻找简单安全无毒的方法来制备理想的丝素蛋白材料。
丝素蛋白呈纤维状,包括非结晶区和结晶区,其中结晶区分为silk Ⅰ型和silk Ⅱ型,非结晶区和silk Ⅰ型结构不稳定。本实验根据丝素蛋白经不同温度加热或有机溶剂处理后其非结晶区与silk Ⅰ型结构易转变为silk Ⅱ型稳定结构, 而silk Ⅱ型结构的材料能从根本上克服上述缺陷的特殊性质制备丝素蛋白膜[10,11]。近年来,国内外有关丝素蛋白膜高值化利用的研究颇多,但迄今为止,采用温度法制备丝素蛋白膜并探讨所制膜的溶失率、胰蛋白酶对膜稳定性和膜动物细胞体外培养影响的研究鲜有报道。胰蛋白酶是一种能够破坏基质和粘附蛋白的蛋白水解酶[12],在细胞的消化传代过程中扮演重要的角色[13,14],其浓度大小及作用时间的长短直接影响细胞的活力。因此,本研究选择细胞消化传代最常用的胰蛋白酶浓度0.25%和0.5%研究丝素蛋白膜抗胰蛋白酶的能力和膜动物细胞体外培养特性,为其在细胞工程领域中的应用提供理论依据。
1实验
1.1原料与仪器
蚕茧(购自甘肃陇南桑蚕中心),无水碳酸钠、无水氯化钙和无水乙醇均为分析纯(购自国药集团化学试剂 有限公司),PBS(无Ca2+、Mg2+,pH=7.20)自配,电子天平(METTLER TOLEDO),生物倒置显微镜(Olympus IX51-FL),紫外分光光度 计 (Biomate-5 Thermo Spectromic),胰蛋白酶 (Gibco),新生牛血清(兰州民海生物工程有限公司提供,批号:20130906),DMEM培养液(高糖,Gibco),Vero和BHK21细胞株(甘肃省动物细胞工程技术研究中心提供)。
1.2丝素蛋白膜的制备
将家蚕生丝浸入0.05% Na2CO3溶液中80 ℃ 脱胶2次,每次30min,用去离子水将生丝表面的丝胶蛋白洗净,自然晾干获得脱胶的丝素纤维。称取20g脱胶的丝素纤维溶解于200 mL的CaCl2/CH3CH2OH/H2O(物质的量 比1∶ 2∶8)三元溶液中,75 ℃缓慢搅拌反应2h,4层医用纱布过滤除渣后将 丝素蛋白 混合液装 入透析袋 (截留分子 量为8000~12000Da),于去离子水中透析96h以除去氯化钙和乙醇,再将所得丝素蛋白溶液浓缩至一定浓度后,取适量注入特定体积的培养皿中,于恒温干燥箱中60 ℃干燥2h,继续升温至120 ℃和180 ℃各维持一段时间,制出匀致透明的丝素蛋白膜。最后取出部分丝素蛋白膜放在25%甲醇中处理0.5h,然后用去离子水冲洗干净,40 ℃干燥至恒重备用。
1.3丝素蛋白膜热溶失率测定
取部分经甲醇处理和未经甲醇处理的丝素蛋白膜,分别记为A组和B组,先在恒温恒湿(25℃,相对湿度65%)下平衡24h。然后从A组和B组各称取质量W1=0.100g的样品,3块作为一个平行,分别放入已编过号的6个锥形瓶中, 按浴比1∶100加入去离子水,在37 ℃的水浴恒温振荡器中预热30min后振荡48h。然后于12h、24h和48h取出溶液并离心,在278nm下检测各上层清液的吸光度并取平均值,根据式(1)计算出丝素蛋白膜的蛋白溶失率[15]。
式中:D为丝素蛋白的溶失率(%);K为丝素溶液的紫外吸光常数(K=0.54);A为吸光度;V为溶液体积(mL);W1为样品质量(g)。
1.4丝素蛋白膜预处理
剪取W2=0.100g的丝素蛋白膜(甲醇未处理)30小块, 用PBS清洗数次并浸泡12h,然后把膜取出置于三角瓶中并加适量PBS浸泡高压灭菌,最后在超净工作台下换用无菌PBS洗涤膜2~3次后分别置于25cm2方瓶和细胞培养6孔板中(含适量无菌DMEM培养液),放入37℃、5% CO2培养箱中备用。
1.4.1丝素蛋白膜的酶处理
用0.25%和0.5%的胰蛋白酶液各10mL单独消化1.4中25cm2方瓶里的丝素蛋白膜48h,倒置显微镜下观察丝素蛋白膜的形态结构并照相,初步判断膜抗两种不同浓度胰蛋白酶的能力。同时在规定的时间点12h、24h和48h将膜取出并用去离子水洗净后置于40 ℃恒温干燥箱干燥至恒重, 然后与W2比较,计算膜的质量变化情况。
1.4.2丝素蛋白膜上动物细胞体外培养
用含10%新生牛血清的DMEM培养液复苏BHK-21细胞和Vero细胞,传代2次待细胞生长致密后用0.25%胰蛋白酶液消化,最后将细胞密度调整为1.0×105cells/mL,分别取2mL细胞悬液接入传统培养6孔板(作为对照)和含有丝素蛋白膜的6孔板中,补加2mL DMEM培养液置于37 ℃、5% CO2培养箱培养,观察细胞的生长状况。当细胞在膜上形成致密单层后,小心移出两块培养BHK-21细胞的膜 (记为膜C和膜D)和两块培养Vero细胞的膜(记为膜E和膜F)至另一新的细 胞培养6孔板中,膜C和膜D依次用0.25%和0.5%胰蛋白酶液各1.0mL单独消化,膜E和膜F做相同处理,在倒置显微镜下观察膜上细胞的消化情况。最后将消化脱落的两种细胞分别在6孔板上连续传代培养5代并与传统培养6孔板中的细胞进行比较,观察消化脱落细胞的生长状况和形态。
2结果与讨论
2.1丝素蛋白膜的热溶失率
A组和B组丝素蛋白膜的溶失率如图1所示。从图1可知,B组丝素蛋白膜48h内的溶失率在0.2% 以下,25% 甲醇处理丝素蛋白膜48h内的溶失率为零(见A组)。这说明在60℃、120℃和180℃条件下制出的丝素蛋白膜构象基本上是SilkⅡ型结构,25%的甲醇可使尚存的少部分非结晶区和Silk Ⅰ型结构全部转变为稳定的SilkⅡ型结构。研究发现在60~120 ℃温度区段,丝素蛋白溶液中水不断发生蒸发,丝素非结晶区中分子间的氢键发生断裂,加剧了分子运动,当温度升至180 ℃时,蒸汽已使绝大部分非结晶区的无规卷曲和Silk Ⅰ型结构向Silk Ⅱ型结构转变[16];25%的甲醇可使膜在几分钟内全部转变成SilkⅡ结构[17],从而降低丝素蛋白膜的水溶性。另外,还发现温度梯度法制出丝素蛋白膜再用甲醇处理,膜表面仍保持洁白透明。而以往流延法制备的丝素蛋白膜不但溶失率高,而且经甲醇处理后膜表面会变得模糊不透明,不利于观察膜上细胞的生长状况和形态, 残留的甲醇也会对生物体产生不良影响。
2.2胰蛋白酶对丝素蛋白膜的影响
用0.25%和0.5%的胰蛋白酶液分别消化丝素蛋白膜A与膜B,分别在0h、12h、24h和48h倒置于显微镜下观察膜的形态结构并称重,结果如图2(A0-A48分别代表0.25% 胰蛋白酶液处理膜A 0h、12h、24h、48h;B0-B48分别代表0.5%胰蛋白酶液处理膜B 0h、12h、24h、48h)和图3所示。
由图2可知,浸泡在0.25%和0.5%胰蛋白酶液中的丝素蛋白膜A和膜B在12h、24h和48h时其形态结构依次同A0、B0基本保持一致,无疏松、破损和溶解等现象,仍保持完整致密结构。再根据图3可看出,与W2=0.100g相比, 经0.25%和0.5%的胰蛋白酶液处理的丝素蛋白膜的质量在48h内无明显变化,这说明丝素蛋白膜在48h内对两种不同浓度的胰蛋白酶均表现出较强的抵抗能力。研究表明丝素蛋白膜中不同的结构对膜材料的降解速率有很大的影响[18],经不同温度加热或甲醇处理后易转变成较难被降解的silk Ⅱ型结构。理想的细胞培养基质要求之一就是材料可在一定时间内保持外观和结构的完整性[19],而以往通过流延法制备的丝素蛋白膜在水溶液中短时间内就会溶解,难以满足实际应用。明胶微载体培养细胞生产单抗和干扰素等生物制品时,在细胞消化传代时微载体易被0.25% 胰蛋白酶和EDTA溶解,难以重复利用,这不但造成了资源的浪费还给收获细胞产品带来一定困难[20]。综上可知,本研究所制丝素蛋白膜具有一定的优势,在生产应用中有重要的潜在价值。
2.3丝素蛋白膜上动物细胞体外培养
2.3.1细胞生长状况
倒置显微镜下观察到BHK-21细胞和Vero细胞24h和48h在丝素蛋白膜上的生长状况如图4所示。
根据图4可知,24h时BHK-21细胞在丝素蛋白膜上已贴壁生长且明显优于左上角的细胞培养板,见图4(a);Vero细胞在丝素蛋白膜上也已贴壁生长,与左边的细胞培养板相比无明显差异,见图4(c)。在48h时,BHK-21细胞和Vero细胞在膜上和细胞培养板上均已形成致密单层,且膜上细胞较左边细胞培养板上长得紧凑,细胞呈梭形以及三角形,分散均匀,形态良好,见图4(b)、(d)。这可能与丝素分子结构性质有关,丝素分子羧基末端的非重复区域含有较多的碱性氨基酸,尤其是精氨酸,同时还含有易于细胞粘附的精氨酸甘氨酸-天门冬氨酸三肽序列。丝素蛋白可促进成纤维细胞、 软骨细胞和干细胞等多种细胞的粘附、增殖和分化,是一种理想的细胞培养基质原材料[21,22]。综上可知,丝素蛋白膜能够很好地支持BHK-21细胞和Vero细胞在其上的粘附生长,温度梯度法所制丝素蛋白膜仍保持良好的细胞相容性。
2.3.2丝素蛋白膜上细胞消化和传代培养
(1)BHK-21细胞和Vero细胞消化
在48h时,0.25%和0.5%胰蛋白酶液消化膜上两种细胞的结果如图5((a)、(b)、(c)分别为0.25%胰蛋白酶液处理膜C上BHK-21细胞0min、1min、3min;(d)、(e)、(f)分别为0.5%胰蛋白酶液处理膜D上BHK-21细胞0min、1min、 2min)和图6((a)、(b)、(c)分别为0.25%胰蛋白酶液处理膜E上的Vero细胞0min、1min、3.5min;(d)、(e)、(f)分别为0.5%胰蛋白酶液处理膜F上的Vero细胞0min、1min、2.5 min)所示。
根据图5(a)、(d)可以看出,48h时BHK-21细胞在膜上均已生长致密,形态正常。当用两种不同浓度胰蛋白酶液单独消化后,1min时发现经0.25%胰蛋白酶液消化处理的膜上BHK-21细胞已逐渐散开圆缩,3min时BHK-21细胞已呈明亮卵圆形,说明已经完成消化;而0.5%胰蛋白酶液处理的膜上BHK-21细胞1min时已圆缩变成卵圆形,2min时已完成消化,见图5(c)和(f)。再由图6可知,0.25%胰蛋白酶液消化膜上的Vero细胞在1min时才缓慢收缩散开,而经0.5%胰蛋白酶液处 理的Vero细胞已经 圆缩,见图6(a)、 (d);到2.5min时,0.5%胰蛋白酶液已完成膜上Vero细胞消化,而经0.25%胰蛋白酶液处理的Vero细胞直到3.5min才完成消化,见图6(c)、(f)。然后再分别吸取适量的DMEM培养液轻轻吹打,膜上BHK-21细胞和Vero细胞易被吹打脱落,而丝素蛋白膜仍保持完整结构。分析可知,膜C和膜D上BHK-21细胞及膜E和膜F上Vero细胞消化时间有所不同,这与胰蛋白酶的浓度直接相关;而BHK-21细胞和Vero细胞消化时间不同,这可能与两种细胞的内在性质有关。 以上现象同两种细胞常规消化传代过程中BHK-21细胞易消化,而Vero细胞相对 难消化的 情况一致。 综上可知, 0.25%和0.5%胰蛋白酶液均可将丝素蛋白膜上BHK-21细胞和Vero细胞在4min内正常消化且丝素蛋白膜仍保持完整结构。
(2)细胞传代培养
由于胰蛋白酶的浓度及作用的时间会影响细胞的活力, 为此将0.25% 和0.5% 的胰蛋白酶液消化脱落的BHK-21细胞和Vero细胞分别在细胞培养6孔板里连续传代培养5代,以传统培养6孔板细胞为对照,结果如图7((a)、(b)、(c) 分别为传统培养6孔板(对照)、0.25%和0.5%胰蛋白酶液消化后连续传代培养5代的BHK-21细胞;(d)、(e)、(f)分别为传统培养6孔板(对照)、0.25%和0.5%胰蛋白酶液消化后连续传代培养5代的Vero细胞)所示。
根据图7可以看出,经0.25%和0.5%胰蛋白酶液消化的BHK-21细胞和Vero细胞连续传代5代,培养48h时细胞形态结构与对照组无明显差异,未出现拉丝、病变等异常情况,细胞生长良好,形态正常,这说明丝素蛋白膜对BHK21细胞和Vero细胞的增殖生长无不良影响。
3结论
(1)温度梯度法所制丝素蛋白膜在去离子水中溶失率低且抵抗0.25%和0.5%胰蛋白酶液的能力强。
(2)丝素蛋白膜具有良好的细胞相容性,能支持BHK21细胞和Vero细胞的正常增殖生长。
再生细胞 篇3
细胞重新编程的历史
细胞重新编程指的是分化的细胞在特定的条件下被逆转后恢复到全能分化的状态，或者形成胚胎干细胞系，或者进一步发育成一个新的个体。而在此之前的一项研究已经提示了这个领域的重大进展，即“诱导性多能干细胞”(又称干细胞样细胞)，该研究曾被评为2007年十大科学进展的第二项。
2007年11月20日美国威斯康星大学的詹姆斯·汤姆森等人在《科学》杂志发表研究成果，而日本京都大学教授山中伸弥领导的研究小组在《细胞》杂志发表研究成果，他们都以逆转录病毒为载体向人体皮肤细胞中植入4个基因(Oct4、Sox2、c-myc、K1f4)，通过基因重新编码，使皮肤细胞具备胚胎干细胞的功能。而被改造过的细胞被称作“诱导性多能干细胞”。
在把人的皮肤干细胞通过基因重新编程改造成干细胞之前，研究人员已经在小鼠身上获得了成功。2006年，山中伸弥等研究人员称，他们发现了一个能避开人体胚胎干细胞伦理限制而获得干细胞的方法。他们将4个基因导入在培养皿中生长的小鼠尾部细胞，得到了外表和功能与胚胎干细胞极其相似的新细胞，这就是诱导性多能干细胞。
现在，研究人员通过插入4种基因，以回拨细胞发育时钟的方法，使细胞成为可以再分化生长的干细胞。而且，研究人员可以从不同疾病的患者身上提取皮肤细胞，将其重新编程为干细胞。这些干细胞在实验室里能生长并分裂，这既可以让研究人员理解疾病的过程，也是干细胞利用的新途径，因而在未来可以用患者自身细胞治疗疾病。
在此之前的两个进展引人注目。一是研究人员用基因技术彻底去除了细胞的发育“记忆”，使其回到原始胚胎状态，然后重新生长成不同的细胞。也就是说，可以通过细胞再编程，让成年细胞重新回到胚胎状态，然后可以发育成各种所需的组织和器官。
另一种方法更为先进。研究人员用活鼠做试验，让细胞直接从一种成体细胞变成另一种成体细胞，打破了细胞单向发育的规则。这种方法的先进之处在于直接，省去了让细胞重新编程变为干细胞的过程。
很多细胞都可以重新编程
2008年细胞重新编程的一个重要成果是对人类一种顽症——肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)的探索。美国哈佛大学的艾根研究小组和美国哥伦比亚大学的研究小组共同从患有肌萎缩性脊髓侧索硬化症病人的皮肤中提取了致病细胞，对其进行基因改造，然后将改造后的细胞注入患者的大脑中，结果令人鼓舞。经过基因改造的细胞在人体内能够正常工作。
肌萎缩性脊髓侧索硬化症又称路葛雷克氏症(俗称渐冻症)，是一种运动神经细胞受损的疾病，患病后肌肉会逐渐萎缩，进而全身瘫痪并死于呼吸衰竭。研究人员是从两位患有肌萎缩性脊髓侧索硬化症的姐妹身上提取的细胞，她们一人为83岁，另一人是82岁。由于这一疾病的遗传性，姐妹俩的祖先中有2％的人患有此种疾病。
研究人员从这两位老人身上提取皮肤细胞后，加入4种基因将这些细胞转变回诱导性多能干细胞。研究人员用这4种基因来重新设定细胞程序，使其演变为诱导性多能干细胞状态的基因，这是细胞重新编程的第一步。然后，研究人员将来自其中一名病人的诱导性多能干细胞沉浸在多种信号分子中，设法使这些细胞成为看上去像是运动神经元的细胞，而运动神经元就是在肌萎缩性脊髓侧索硬化症中遭损害的细胞。
这一做法的目的是，用诱导性多能干细胞来制造在遗传上与病人相匹配的健康细胞，并取代病变的细胞，这样不会产生排异反应。但是，在将这种方法安全地用于人身上之前，仍然有重大的障碍需要克服。而且，在实施中也可能有麻烦，例如，通过重新编程的细胞变成干细胞后是否会难以控制其生长。如果不能控制，就容易诱发癌症。
此后，美国哈佛大学干细胞研究所的乔治·戴利等人与其他研究人员合作，创立了20个诱导性多能干细胞系，它们代表的是10种疾病，包括腺苷脱氨酶严重联合免疫缺陷症、Ⅲ型戈谢病、杜兴氏肌肉萎缩症、贝克肌肉萎缩症、唐氏综合征、帕金森病、青少年糖尿病、舒－戴二氏综合征、亨廷顿舞蹈病、莱施－奈恩二氏综合征(携带者)。
对这些疾病建立诱导性多能干细胞(干细胞样细胞)也是利用细胞重新编程的方法，而这是建立疾病干细胞样细胞库的开始，有助于研究多种疾病。同时，哈佛大学的研究人员还承诺将免费向全世界的科学家提供疾病干细胞样细胞系资源。让一种细胞转化成另一种细胞
进一步的研究还获得了细胞重新编程以获取干细胞的新认识，即再编程的目标并不一定要回到胚胎状态，而是可以让细胞直接变成另一种新的成体细胞。这就是利用基因重组技术，实现不同种类成体细胞之间的直接转化，也因此，这代表了再生医学的更为直接和先进的方向。
哈佛大学医学院的周桥和波士顿儿童医院的道格拉斯·梅尔顿研究小组通过注射冷冻的普通腺病毒，把3种基因(Ngn3、Pdx1、Mafa)送入体内缺乏胰岛B细胞的病鼠胰腺内，结果鼠的胰腺内大约20％的外分泌细胞转化成胰岛B细胞。胰岛B细胞增加，分泌的胰岛素相应增多，病鼠体内过高的血糖水平降低，糖尿病病情便减轻。
腺病毒携带的3种基因具备将普通细胞转化成胰岛B细胞的功能。胰岛B细胞数量稀少，如果受到破坏，就会引发I型糖尿病。而外分秘细胞在胰腺中较常见，大约占胰腺的95％。
不过，尽管腺病毒作为载体比较安全，但研究人员还是希望找到避免使用病毒的方法，不把3种基因注入人体中，否则风险较大，也因此会招致美国相关管理部门的反对。
利用细胞重新编程获得干细胞还有其他多种方法。例如，把胰腺中的成熟的胰腺细胞(又称外分泌细胞)再编程为胰岛B细胞，也可以采用引进4种基因的方法。美国麻萨诸塞州总医院癌症研究所和再生医学中心的马塞厄斯·斯达特费尔德研究小组用这样的方法也成功地让小鼠的胰腺外分泌细胞转化成胰岛B细胞。
这种情况对旧有的医学现象和理论是一种颠覆，因为在生物体内，分化了的细胞几乎从来不改变发展方向，比如从肌细胞变成肺细胞。然而，这种细胞的直接再编程对治疗某些疾病来说比采用多能干细胞更简单、更安全。这项技术也许能使科学家
们加快在实验室培养所需的细胞类型，用确定的因子把培养的一种细胞变成另一种细胞。安全的担忧和改进技术
但是，细胞重新编程既然是改变细胞的一种方式，这也意味着会永久改变细胞DNA，造成安全隐患。因为，把外源性基因插入细胞的基因组中可能会改变现有的基因，例如防癌基因，导致细胞容易形成肿瘤。尽管插入的基因在重新编程结束后自动关闭，让细胞自身的基因接管，但研究人员仍然担心插入的基因会再激活或者对细胞产生其他微妙的影响。
例如，引进4种基因(Oct4、Sox2、c-myc、K1f4)进行细胞重新编程的方法需要用4个独立的病毒，每个病毒对应1个重组基因，才能将基因转移到细胞的DNA中。而这些病毒可能会把这4个基因植入到细胞DNA中的任何部位，因此有可能引发致癌基因的表达，引起癌症。
为了避免这种危险，研究人员正在尝试多种方法。例如，美国怀特海德生物医学研究所的研究人员尝试将4个重组基因串联起来，用一种病毒把它们植入成年实验鼠和人类细胞的基因组，结果显示这种方法能够表达所有4种重组基因，从而启动细胞重新编程。而这种在基因重组过程中把所需病毒的数目从4个减少到1个的方法能极大地简化诱导多能干细胞的生成，同时也增加了安全性。
另一方面，日本的研究人员也发现，一种称为质粒的DNA环状体也可以将启动细胞重新编程的基因载入细胞。另外，腺病毒也是基因工程中常见的一种载体病毒，该病毒导致常见的感冒，但并不将自己插入细胞的基因组中。腺病毒的功能是，能长时间地表达插入的外源性基因，将细胞重新编程。但是随着细胞分裂，病毒被稀释到检测不到的水平，使重新编程后的细胞内原来的基因组保持不变。
但是这些比较安全的插入外源性基因以启动细胞重新编程的方法在效率上似乎又较低。这也逼迫研究人员探索既安全又有效率的方法。如今，在大多数实验中，1万个细胞中能被成功重新编程的细胞少于1个。不过，美国加利福尼亚州和西班牙的两个研究小组发现一种叫做角质细胞的皮肤细胞特别容易重新编程。研究人员能把大约1％的角质细胞重新编程，整个过程只要10天，而其他细胞则需要好几个星期。毛囊是角质细胞的一个丰富来源，研究人员称，他们从人头上拔下的一根头发的细胞中获得了个性化的细胞系。而从头发获得细胞比切下一块皮肤要容易得多。
最后的情况是，既然研究人员绕过胚胎干细胞而用多种方法获得各种干细胞，但现阶段还只是在实验室中可以让干细胞转变成特定的细胞和组织，例如让干细胞转变成有心博的心脏细胞。然而，这些细胞是否能融入病人的组织并替代或修复患病的细胞和组织，仍有很多技术和难关需要攻克。(文章代码：0203)
干细胞和再生医学的故事 篇4
干细胞大家族
干细胞可是一个大家族，根据不同的分法可以分为以下几类。根据它的发育等级和分化能力，可以分为全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。
全能干细胞：
顾名思义就是啥样的细胞都能变，实际上全能干细胞能形成一个新的生命个体。也就是说，从这一个细胞出发，经过分裂、增殖、分化最终可以得到一个完整的生物。目前，对人体来说这样的细胞只有两种：一是，受精卵;二是，四分体时期的细胞(有的科学家认为四分体时期的细胞也具备全能性，不过没有达成广泛共识)。可惜的是，后者以目前的科学技术还没有办法把它们分离出来传代培养(就是让它们不停地分裂还能保持原有的功能特点)，所以我们实际上很少研究它。
多能干细胞：
与全能干细胞的区别，是后者“啥都能变”，前者却是“能变很多种”。也就是说，多能干细胞可以变成几种不同的细胞，但不是所有种类的细胞都能变，比如“造血干细胞”，所以它们永远没办法形成一个完整的生物个体。
单能干细胞：
自然就是只能变一种至多是两种细胞的干细胞。
其次，根据干细胞的来源，我们还可以把它们分成胚胎干细胞和成体干细胞。最新的研究中还有一类新的干细胞，就是诱导多能性干细胞。
热门美剧《实习医生格雷》第七季里有一集，讲到一个小女孩因为肿瘤失去了气管，医生们用她自己的干细胞再造气管，进行移植的故事。虽然这个故事被讲得错漏百出，但利用自身的干细胞治疗和修复机体，确实是现实中已经被广泛应用的一系列技术了。这些医疗手段的基础就是成体干细胞。成体干细胞正是在现实医疗中应用最多的干细胞治疗手段。
另一部被改成电影的朱迪·皮考特最著名的小说《姐姐的守护者》，讲的则是关于干细胞治疗的道德拷问：小女孩安娜的出生就是为了用她的干细胞来治疗自己姐姐的病，后来她将自己的父母告上法庭，要争取自己的“身体支配权”，最终却因车祸而亡，留下了健康的肾脏，还是捐给了自己的姐姐。这里提到的治疗使用的正是胚胎干细胞。这一研究已引来一系列质问：胚胎算不算人类?什么样的胚胎就应该被当作“人”来尊重?为了拯救一个生命而创造另一个生命是否道德?等等。
此外，有一部很好看的电影《本杰明·巴顿奇事》，由布拉德·皮特主演，讲一个婴儿一出生就是一副古稀老人的状态，被寄养在老人院，结果居然越长越年轻，最终变成了一个婴儿死去了。抛开它的哲学内涵不谈，人世间是不是真的会有这样的“奇事”呢?事实上，作为一个“人”当然不会有，但是“人”的细胞却确实可以“越活越年轻”——当然，这是在科学家们的调控之下做到的。这就是我们所讲的“诱导多能性干细胞”。
干细胞技术令再生不是梦
事实上，人体之所以有一定的再生能力，主要是靠着成体干细胞。比如，表皮的再生、血细胞的换新、头发指甲的生长之类。关于再生医学中的成体干细胞的研究，最早始于20世纪60年代对造血干细胞的研究，造血干细胞目前为止是应用得最成熟的成体干细胞，可应用于治疗多种血液系统恶性肿瘤、某些实体瘤、某些自身免疫性疾病和某些遗传病;之后，人们又发现了对皮肤的修复和再生至关重要的上皮干细胞、在神经组织中起重要作用的神经干细胞等。
还记得系列科幻电影《超人》的主要扮演者克里斯多夫·李维吗?身高193公分、拥有美国康乃尔大学学历的李下，不幸于1995年参加马术比赛时摔落马下，脊椎严重受伤，颈部以下全部瘫痪。但他一直努力想要重新站起来，不仅离开了病床积极接受复健，更致力于推动胚胎干细胞的研究，只可惜他最后还是于因为心脏衰竭在纽约过世，终年52岁。或许有一天，科学家们可以依靠神经干细胞的研究，让这些“折翼的天使”重新康复。
胚胎干细胞的研究从长远来讲，在再生医学中也具有更辉煌的前景。比如生殖系干细胞的研究，就可以被用来研究不育不孕症，为千千万万没有孩子的家庭造福。现在医学研究中，用“核移植”的方法来获取胚胎干细胞，其实已可以避开部分伦理道德的争议。
此外，诱导多能性干细胞则无疑是最近几年干细胞学界、甚至是生物学界最重要的发现。最重要的优势就是，它规避了胚胎干细胞研究的伦理壁垒，用成体干细胞来培养出胚胎干细胞，完全可以做到“用你自己的细胞治疗你自己的疾病”。
总之，现代的再生医学早已经取得了飞速的发展：208月，德国科学家斯米勒等人成功地复制了一位56岁患者的下颌骨，就像吴宇森的电影《变脸》一样，那位原本不能正常进食的患者成功地获得了一张“新脸”，而且还恢复了正常的饮食生活。
斯米勒等人先用电脑扫描，模拟出患者下颌骨的尺寸大小，做出钛合金的金属支架，再从患者的骨髓中取出骨髓干细胞，与生长激素混合在一起，涂抹在钛合金金属支架上，一起移植在患者的右肩胛骨里，经过8个星期的“体内”培养之后，成功的复制出了患者的下颌骨。他们再将培养好的下颌骨取出，移植到患者的下巴上，这样，患者就成功地得到了一个“新下巴”。这是世界上首例成功使用背部肌肉血液培养下颌骨的案例。
后来，美国俄亥俄州克利夫兰的亚特里奥赛特公司利用约翰霍普金斯大学研究出的一种以纳米纤维为基础的体外细胞扩增的新技术，还可以利用造血干细胞在体外大量生产血液。
近年来新进展、新成果简直令人瞠目结舌。有人提出，我们这一代人也许是“最后一代原装人”，因为再生医学的发展可以使我们活到120岁、150岁甚至更长。在这1左右的时间里，人类科技的发展就有可能使我们“长生不老”——又也许是可以不要肉体，只把我们的意识保留在计算机中，云云。
再生细胞 篇5
1 神经干细胞的来源
2000年,Gage[4]将神经干细胞来源概括为以下5个方面,(1)胚胎组织来源神经干细胞:来自于胚胎形成的最早阶段—囊胚,其内层细胞团的细胞就是胚胎干细胞。(2)成体组织来源神经干细胞:是存在于不同组织器官中的未分化细胞,它具有自我更新的能力并可以分化成不同种类的细胞。(3)神经嵴细胞。(4)原代细胞培养:从脑内特定的部位分离出来,并在体外合适的条件下培养,可直接用于神经细胞移植。(5)建立“永生化”神经干细胞系,通过反转录病毒将编码癌基因蛋白克隆到胚胎神经干细胞中,改变细胞的表型,使部分细胞获永生化。目前在我国大多将动物胚胎脑组织、胚胎干细胞、人胚胎干细胞等用于基础研究,而骨髓来源、脐血来源干细胞大多应用于临床。
2 神经干细胞的生物学特性
神经干细胞有高度增殖、自我更新及分化能力,其生物学特性可以归纳为以下几点,(1)分化性:通过不对称分裂产生除自身以外的其他细胞,分化形成神经细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞等。(2)迁移性:能到达损伤或疾病的部位并产生新的神经细胞。(3)趋化性:神经干细胞具有位置特异性的分化潜能,可生成神经组织细胞。(4)免疫原性:免疫原性较弱,在移植后免疫排斥反应较轻,有利于移植物的存活。因为上述特性,神经干细胞成为了神经系统疾病较理想的移植材料[5,6]。
3 神经干细胞移植修复脊髓损伤的作用机制
神经干细胞修复脊髓损伤的机制一般可认为:(1)通过产生外源性神经元,与神经系统相整合,并形成新的神经突触,重建神经元回路。有研究表明,神经干细胞移植入神经组织后可整合入神经系统,分化产生新神经元,将有缺陷或死亡的神经元替代,与周围的神经系统建立起正确的突触联系恢复部分神经功能[7,8]。(2)分化产生胶质细胞,促进新生的神经纤维和残存脱髓鞘的神经纤维髓鞘化,以恢复神经结构的完整性。(3)对神经进行保护及免疫抑制作用,可以减少脊髓周围组织坏死,抑制炎症、胶质瘢痕形成、细胞的再损伤。(4)分泌一些神经营养因子,从而对神经通路重建及功能恢复起重要作用[9,10]。
4 神经干细胞的移植时机及途径
在脊髓损伤后1周左右的时间里,由于组织水肿、溶酶体损伤和毒性物质释放会发生残端变性、坏死和空洞形成,产生脊髓损伤后自切现象。因此,在损伤后1周左右进行移植可以阻碍瘢痕生成,有益于移植成功。植入途径基本可以分为两种:(1)原位移植。将细胞直接移植到损伤区的周围,使损伤部位神经干细胞高密度存在,利于局部神经纤维的再生;(2)通过静脉及脑脊液移植,神经干细胞可以到达损伤部位,从而修复脊髓损伤[11]。
5 神经干细胞的移植方式
5.1 单纯神经干细胞移植
Nakamura等[12]用Brd U标记人神经干细胞后移植到脊髓损伤的猕猴,发现移植组猕猴神经微丝的生长、前肢肌力以及自发性运动活动均优于对照组,从而证明了神经干细胞可以存活、迁移、分化,可促进肢体运动功能的恢复。吴宗辉等[13]应用L4平面的脊髓全横断模型探讨大鼠神经干细胞移植在恢复脊髓损伤(SCI)传导功能的机制时,采用BBB评分、皮层体感诱发电位和辣根过氧化物酶(HRP)逆行示踪技术三项指标评价大鼠脊髓运动和传导功能的恢复程度,发现移植组的各项指标均好于对照组。Lu等[14]发现经RT-PCR检测移植的干细胞能在活体内表达神经营养因子,表达神经营养因子3(NT-3),促进宿主轴突生长,认为神经干细胞在神经系统损伤后有替代缺失组织的潜能。杨万章等[15]客观总结和评价神经干细胞治疗神经系统疾病综合效果后得出对于截瘫患者应用神经干细胞治疗后肌张力或痉挛程度明显下降,有实质性的改变,总体治疗效果较好。
5.2 基因修饰神经干细胞移植
该方法的基本策略主要是通过转基因技术给损伤脊髓局部提供适合干细胞生长、分化的微环境。Castdlanos等[16]将trk-C基因和NT-3因子修饰的神经前体细胞移植到完整的大鼠脊髓内,发现两种处理因素联用能促进神经干细胞的存活,填补脊髓空洞、促进β-微管蛋白纤维在移植细胞周围的增生。Kegami等[17]运用硫酸软骨素酶注射联合神经干细胞移植治疗SCI,比较基因介导组与单独移植组的区别,发现硫酸软骨素酶能降低CSPG对移植细胞迁移的抑制作用,促进移植细胞与宿主的融合。Zhang等[18]通过构造p NT23表达载体,以SHN2方式整合到NSCs C1712中,然后移植到脊髓损伤大鼠体内,通过实验发现,移植30 d后,SHN2在损伤区明显增多,通过BBB评分发现大鼠运动功能明显恢复,表明NT23和NSCs联合移植可以促进SCI的恢复。
5.3 复合生物支架联合神经干细胞移植
Murakami等[19]使用包埋在胶原中的神经前体细胞来修复大鼠15 mm坐骨神经的缺损并获得成功,证明胶原可促进神经干细胞的生长和分化。侯天勇等[20]将脊髓神经干细胞接种于Sapeptide材料上,对材料上的分化细胞进行生长相关蛋白43和缝隙连接蛋白32染色评价,结果脊髓神经干细胞增殖和分化良好。Suzuki等[21]使用藻酸盐为载体填充损伤的脊髓后,将胚胎海马源性的神经干细胞(主要为NSC)注射在损伤部位,2周后发现神经干细胞明显移行并到达损伤部位上游。
6 问题与展望
再生细胞 篇6
干细胞是身体的主控细胞, 产生所有的身体组织和器官。胚胎干细胞可以产生任何组织, 因此功能最强大。然而, 许多人反对使用胚胎干细胞, 他们认为, 在生命最初的几天, 从一个胚胎中获得胚胎干细胞会导致胚胎死亡, 因此, 胚胎干细胞一直处于巨大的伦理争议漩涡中。
2007年, 日本和美国科学家证明, 能够使用混合基因来改变普通皮肤细胞的“生物钟”, 将它们变成功能强大的诱导多能干细胞, 这样得到的干细胞和胚胎干细胞的功能相差无几, 这一发现被《自然》和《科学》杂志分别评为2007年第一和第二大科学进展。
但有人担心, 为了让基因进入细胞中, 科学家将不得不使用病毒, 病毒将自己的遗传物质整合进入它们传染的细胞, 这个过程可能引发癌症, 因此, 这也极大地限制了iPS细胞的发展应用。
英国和加拿大的研究人员首次不使用病毒研制出了iPS细胞。英国医学研究理事会 (MRC) 再生医学部门的加地庆介和加拿大多伦多大学的纳吉·安德斯利用名叫“转位子”的DNA片断 (也称跳跃基因, 因为它能够携带4个基因在遗传代码里四处游荡) 来替代病毒作为运输所需基因的载体。
研究人员在老鼠和人类的皮肤细胞上使用了这项技术, 并且发现, 重新编程的iPS细胞和胚胎干细胞的表现一样。将这些iPS细胞暴露于合适的化学物质和蛋白质中, 可以将其变成大脑神经、胰岛素、胰腺细胞、骨头、软骨或其他组织。更重要的是, 从病人的皮肤中制造这些干细胞意味着身体不会出现排斥反应。
加地庆介说:“这个新的方法将改变再生医学的面貌, 并且帮助我们理解疾病、测试新药。或许某一天, 我们可以不需要人类的胚胎来制造干细胞。”
再生细胞 篇7
1 材料和方法
1.1 病例选择
2005年2月~2007年10月确诊或复发的AA患者40例, 在此之前一个月内未接受免疫相关治疗, 检测时无明显的感染症状, 其中慢性再障 (CAA) 28例, 重型再障 (SAA) 12例。正常对照组为2005年6月~2007年6月在我院接受常规体检且各项指标在正常范围内的健康体检者30名, 男18名, 女12名, 年龄18~50岁, 性别年龄与患者组无显著差异[2]。
治疗方法:
(1) 常规治疗组:以康力龙为主的雄激素治疗;
(2) 联合免疫治疗组:在常规治疗基础上加用免疫抑制剂, 如单加环包素A (Cs A) 或与人体免疫球蛋白联合使用, 并可适当添加其他辅助治疗和支持治疗, 如输新鲜血、抗生素等预防和控制感染。
1.3 诊断及疗效标准
参照张之南等编著1998年第二版《血液病诊断及疗效标准》[1]。
1.4 检测方法
AA患者及对照组均空腹采晨血, 检测T细胞亚群的表达情况。AA患者分治疗前后测定。T细胞亚群测定采用流式细胞技术, 仪器型号为XL-EPICS, 由美国贝克曼—库尔特公司生产, 试剂盒由美国COULTER公司提供。
1.5 统计学处理:
应用SPSS11.0软件包。T细胞亚群检测结果以表示, 并进行方差齐性F检验, 治疗效率比较以X2检验或确切的概率分析。
2 结果
2.1 AA患者T细胞亚群分布情况
所有AA患者与正常对照组比较可见AA患者外周血CD3+、CD8+T细胞占淋巴细胞百分比显著高于对照组, CD4+T细胞与正常对照组无明显差异, CD4+/CD8+明显低于对照组 (表1) 。进一步具体分析各项数值发现AA患者每项指标的SD值均高于正常对照组, 以此提示个体差异非常大。为了更准确地反映AA患者与T细胞亚群之间的关系, 参照本室的T细胞亚群CD4+/CD8+正常参考范围及每例患者的检测结果, 将AA患者分成3个免疫亚型, 即CD4+/CD8+正常、CD4+/CD8+倒置型、CD4+/CD8+超高型 (表2) 。
2.2 CD4+/CD8+与AA患者病情之间的关系
根据患者入院时三系减少程度及骨髓分析结果, 按全国统一标准[1]可将AA分为CAA和SAA两大类。SAA中CD4+/CD8+倒置型明显高于CAA (表2) 。
2.3 CD4+/CD8+与AA患者治疗疗效之间的关系
2.3.1 常规治疗组的总有效率 (基本治愈+缓解+好转) [1]显著低于联合免疫抑制组 (38.75%, 67.85%, p<0.05) 。
2.3.2 三个免疫亚型的两种治疗法比较分析总有效率可见CD4+/CD8+比值正常这两者之间无显著性差异;CD4+/CD8+比值倒置者, 采用联合免疫治疗时总有效显著高于常规治疗组 (81.2%, 37.5%, p<0.05) 。
2.3.3 三个免疫亚型采用相同治疗方案分析比较:常规治疗三个亚型无显著差异, 但联合免疫治疗时, 免疫异常型均显著高于比值正常型患者 (84.68%, 81.2%, 54.5%, p值均<0.05) 。
3 讨论
AA的发病机制除与造血干细胞本身缺陷、造血微环境损伤有关外, 免疫异常是一个绝对不可忽视的因素。但准确鉴别三种致病机理的手段非常有限, 而明确发病机制对患者选择治疗方案和预后评价有重要价值[3]。目前临床最常用来了解患者细胞免疫状态的实验室指标就是T细胞亚群检测。本实验显示AA患者外周血淋巴细胞中CD3+细胞百分比明显高于对照组, 提示AA发病与T淋巴细胞介导的细胞免疫有密切的关系。从T细胞亚群看与对照组比较CD4+细胞低, CD8+细胞却明显增高, 导致CD4+/CD8+比值倒置 (P<0.01) (表1) 。这与傅晋祥等[4,5]研究结果基本相符。这进一步提示CD8+细胞可能参与了AA的免疫发病机制, 也说明T细胞免疫机制在再障发生中起重要作用。但具体分析个体间数值时发现, AA患者T细胞亚群各项指标的均值标准差较正常对照组大, 说明个体之间的离散程度非常大。为了更准确地反映AA患者与T细胞亚群之间的关系, 根据本室建立的T细胞亚群CD4+/CD8+正常参考值范围 (1.02-2.00) 及每例患者的检测结果[2], 又将AA患者分成了三个亚型 (比值正常型、比值倒置型、比值超高型, 表2) , 其分布为比值正常型占40.0%、比值倒置型占45.2%、比值超高型占15.0%。由此可见, AA患者细胞免疫状况比较复杂, 可能存在着多种调控途径引起的免疫紊乱, 如果将CD4+/CD8+作为判断患者免疫异常的指标, 免疫异常型共占AA患者的比例为60.2%, 该数值与相关报道的数值为40%~70%相符合[6,7]。值得注意的是SAA中CD4+/CD8+倒置型占66.7%, 显著高于CAA患者中CD4+/CD8+倒置型的38.7% (P<0.05) , 这提示SAA的发病可能与免疫异常的关系更密切。
通过对40例AA患者治疗情况回顾性分析发现, 两种方法治疗的总有效率57.5% (23/40) , 此疗效是根据基本治愈、缓解、好转作为有效来计算的。常规治疗组总有效率低于联合免疫抑制治疗组 (38.75%, 67.85%, p<0.05) , 提示总体上联合免疫抑制治疗方案优于常规治疗。然而, 进一步分析三个免疫亚型组采用不同治疗方法的总有效率后发现CD4+/CD8+正常的AA患者, 两种治疗方案没有显著性差异;而免疫异常型 (即比例异常型) 患者采用联合免疫抑制治疗时, 其总有效率显著高于常规治疗组 (81.2%, 37.5%, P<0.05) ;这一结果提示, 只有对免疫检测有异常的, 特别是CD4+/CD8+倒置型 (84.6%, 40.0%, P<0.05) 的AA患者采用联合免疫抑制治疗才会取得明显疗效。另一方面, 分析和比较患者采用不同治疗方案时各免疫亚型组之间的疗效发现, 常规治疗时三个亚型组之间无明显差异;但联合免疫抑制治疗时, 免疫异常型患者显著高于比值正常者 (81.2%, 84.6%, 54.5%P值均小于0.05) (表3) 。尤其在SAA患者中联合免疫抑制疗法的有效率更高。这些结果均与国内报道一致[8]。这进一步证明了AA患者发病机制、病情、治疗之间的密切关系。
注:再障与正常对照比较▲P<0.01
注:SAA与CAA在CD4+/CD8+比例倒置型中的比率比较■P<0.05
注:与正常型比较▲P<0.05与常规治疗组比较■P<0.05
从上述分析可见, 患者体内是否存在免疫异常对AA患者的病情及联合免疫治疗的效果有显著影响, SAA患者中CD4+/CD8+异常检出率明显高于CAA患者。CD4+/CD8+比值异常型患者联合免疫疗法的有效率显著高于正常型, 而比值正常者用联合免疫疗法并没有明显提高, 因此, AA患者T细胞亚群测定, 尤其是CD4+/CD8+, 对了解患者免疫状况、合理选择治疗方案、提高诊断水平, 甚至减轻患者经济负担都有重要价值。
摘要：目的:探讨再生障碍性贫血患者治疗前后外周血T淋巴细胞亚群检测的变化及其在不同治疗中的意义, 为合理治疗提供依据。方法:采用流式细胞技术检测40例再生障碍性贫血患者治疗前后外周血T淋巴细胞亚群检测的变化及CD4+/CD8+, 并根据其比值与正常对照组比较将患者分为比值正常型、比值倒置和比值超高型3个免疫亚型。同时按常规治疗和联合免疫抑制治疗进行疗效比较。结果:单独常规治疗时, 3个亚型组之间疗效无明显差异;联合免疫抑制治疗时, 比值正常型患者的总有效率与常规治疗组无显著差异, 而免疫倒置型和免疫异常型 (比值减低和增高) 患者总有效率较同组常规治疗疗效均显著提高 (P<0.05) , 也显著高于比值正常者 (P<0.05) 。结论:大多数再生障碍性贫血患者存在着CD4+/CD8+的失调。再生障碍性贫血患者的发病机制与免疫异常有密切的相关性。T淋巴细胞亚群检测对临床了解病情和发病机制、合理选择治疗方案、提高诊断和治疗水平都具有重要价值。
关键词：再生障碍性贫血,免疫异常,T淋巴细胞亚群,CD4+,CD8+
参考文献
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