人防御素 篇1
本报西安11月26日电 (杜峻晓、支勇平) 11月25日, 由我国著名动物胚胎工程专家、西北农林科技大学张涌教授历时10年主持培育的世界首例转人防御素基因克隆奶牛, 在陕西杨凌科元奶牛场通过剖腹产降生。这头克隆奶牛出生体重达40.1公斤, 体格健壮, 毛色光亮。
专家介绍说, 此次降生的转基因克隆奶牛是科研人员通过基因工程的方法将人特异表达的防御素基因与奶牛β-酪蛋白启动子结合, 得到人防御素基因乳腺特异性高效表达载体, 并将其导入高产的奶牛皮肤成纤维细胞中, 经过体外培养及筛选后, 用体细胞克隆的方法成功得到的。
来源:新浪-人民网
人防御素 篇2
1 哺乳动物防御素的分类、分子结构及表达部位
成熟的防御素是一类分子质量为3.5～6 ku的非糖基多肽, 一般富含精氨酸, 带正电荷, 有6个保守的半胱氨酸残基, 根据分子内半胱氨酸的位置和连接方式、前体的性质、表达位置的差异, 可以将哺乳动物防御素分为α-防御素、β-防御素、θ-防御素。它们主要存在于多形核中性粒细胞、巨噬细胞、小肠潘氏细胞及多种组织上皮细胞内。
1.1 α-防御素
成熟的α-防御素是由29～36个氨基酸残基组成的短肽, 分子内含有由6个保守的半胱氨酸 (Cys) 形成的3对二硫键, 二硫键的连接位置分别为Cys1-Cys6、Cys2 -Cys4、Cys3 -Cys5, 其中Cys1 -Cys6连接N端和C端, 形成分子大环[3]。二级结构是由3对二硫键形成的稳定反向平行的3股β-折叠片结构域。α-防御素仅在哺乳动物的组织中合成, 主要分布于人类、兔、猪、鼠类的嗜中性粒细胞、兔子的齿槽巨噬细胞及人类和啮齿动物的小肠潘氏细胞中, α-防御素在嗜中性粒细胞内含量最丰富。
1.2 β-防御素
目前, β-防御素是最受关注的一类防御素。成熟的β-防御素由38～42个氨基酸残基组成, 其分子内在特定位置上包含6个保守的半胱氨酸和其他决定β-防御素结构和功能的保守氨基酸, 分子链内二硫键的连接位置分别为 Cys1 -Cys5、Cys2 -Cys4、 Cys3 -Cys6。β-防御素主要存在于哺乳动物体内, 在禽类中也有表达, 广泛分布于人、鼠、牛、羊、骆驼、驯鹿和猪的多种器官上皮细胞内, 单核细胞和巨噬细胞通常缺乏β-防御素, 但是它们可以诱导上皮细胞合成β-防御素的信使。
1.3 θ-防御素
θ-防御素是在灵长类动物中所发现的具有活性的基因家族。θ-防御素的成熟肽由18个氨基酸残基组成, 其分子结构呈环形, 由6个半胱氨酸形成3对分子内二硫键, 以Cys1 -Cys4、Cys2 -Cys5、 Cys3-Cys6方式连接。
哺乳动物体内的防御素分子中不含有α螺旋, 只有3个分子内二硫键维持β折叠的稳定。
2 哺乳动物防御素的生物学作用及其机理
2.1 生物学作用
无论在细胞内或细胞外, 防御素都可以直接杀死细菌、真菌、病毒等病原微生物。在细胞内环境中, 它们通过吞噬微生物而使厌氧菌死亡;当被释放到细胞外环境中时, 它们通过攻击微生物外膜发挥抗菌活性[4]。除此之外, 防御素还作为机体内外免疫系统的“仲裁者”进行免疫调节以及创伤和神经损伤的修复。防御素在宿主的嗜中性粒细胞、黏膜表面、皮肤和其他上皮细胞免疫中起重要作用, 其定位和调控是通过抵抗病原的侵袭和内生细菌的生长两种途径来实现的。
2.1.1 α-防御素
α-防御素通过透化靶细胞的外膜发挥抗菌活性。在人类, α-防御素存在于小肠中性粒细胞和潘氏细胞中, 作为前体肽产生和贮存, 能够调节肠内菌群, 是肠内疾病的重要调节因子。研究表明, 人的α-防御素-5具有抗寄生虫作用[5]。马的肠内α-防御素仅在潘氏细胞内产生, 有广泛的抗菌谱, 能够有效地抑制人和马体内的病原菌。有人通过对临床上感染疾病的病畜隔离群体进行研究, 结果表明α-防御素重组肽对红球菌、不同的链球菌、沙门杆菌、出败血性巴氏杆菌凸显出有力的抗性, 并对这些病毒具有高度的敏感性[6]。C.Hadjicharalambous 等[7]通过比较小鼠自然状态下的α-防御素及二硫化物缺失的变体α-防御素Crp4, 得出后者的抗菌活性更强。
2.1.2 β-防御素
β-防御素在免疫系统中发挥重要作用, 是致病微生物的有效抑制剂。β-防御素是多功能的活性分子, 是多形核嗜中性粒细胞厌氧杀菌系统的主要成分, 作为原生代的生物标记有很大的潜力。H.Das等[8]利用反向高效液相层析技术提纯4种水牛的β-防御素, 它们均可抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、白色念珠菌、牛瘟麻疹病毒 (RPV) 及新城疫病毒 (NDV) 。K.Thevissen等[9]通过试验对自然状态下的牛奶和采自有乳房炎疾病患牛的牛奶进行比较, 在后者牛奶中发现抗菌肽, 利用氨基酸测序结果表明, 表达的2种抗菌肽为β-防御素, 即牛的舌抗菌肽 (LAP) 和中性粒细胞β-防御素-2。β-防御素在牛奶中的高效表达可以认为是从细胞和分子水平上对细胞损伤的一个回应。
2.1.3 θ-防御素
θ-防御素是具有广谱抗菌活性的血凝集素, 对革兰阳性菌和革兰阴性菌均有抗性, 但主要抗革兰阳性菌。
2.2 作用机理
哺乳动物防御素含有亲水性和疏水性的β-片层结构, 这种结构特征能在脂质膜上形成离子通道, 使动物防御素不同于其他的抗菌肽 (仅作用于病原体的酶) , 直接作用于病原体的细胞膜, 通过透化细菌外膜防止细菌侵染宿主[10], 靶细胞不会对其产生抗性, 所以它具有高效、广谱的抗菌作用, 且不会像抗生素那样产生抗药性和不良反应。作为一种新型的生物活性肽, 其作用机理非常特殊。首先, 带正电荷的防御素与带负电荷的靶细胞膜相接触, 随后通过靶细胞膜所产生的电动势将形成疏水面的防御素二聚体注入细胞膜, 最后多个二聚体一起形成跨膜的离子通道, 使膜通透化, 从而扰乱细胞膜的通透性, 导致细胞膜去极化, 呼吸作用受到抑制, 同时细胞ATP含量下降, 最终使靶细胞死亡。在防御素与靶细胞膜相互作用的过程中, 靶细胞的磷脂, 特别是双磷脂酰甘油对防御素穿透有很大的影响[11]。防御素的表达水平受炎性细胞因子、环境的盐浓度、离子种类、温度等的影响, 通常情况下10 mmol/L的磷酸盐缓冲液 (PBS) 为最佳, 过高的盐浓度会导致防御素活性急剧下降;另外, 二价离子 (如Ca2+、Mg2+等) 能明显降低防御素的活性, 一价离子对防御素活性影响较小。
3 防御素的应用
3.1 在基因工程方面
防御素具有广谱的抗菌活性, 使防御素在基因工程上具有很大的应用潜力。一方面可以人工合成或从组织中分离防御素基因, 然后导入动物体或植物体内表达, 不但可以增强动物或植物的抗感染能力, 同时使有益菌的活力得以提高;另一方面可以研究高效的细菌或酵母表达系统, 以期大量生产防御素, 并将其应用到食品、医药、临床和农产品加工领域, 减少化学抗菌剂在农业上的使用, 从而提高人们的生活质量。研究者尝试通过基因工程途径来获得抗菌肽, 该途径已经在原核体系与真核体系中获得成功, 多种防御素已在不同的表达体系中得到表达。有人将牛的中性粒细胞β-防御素与原核表达载体PET-32a进行连接, 在大肠杆菌中进行表达, 结果表明β-防御素不仅对革兰阳性菌和革兰阴性菌有抑菌作用, 同时对乳房炎也有一定的治疗效果[12]。
3.2 在临床应用方面
防御素一方面具有抗细菌、真菌、螺旋体、病毒、肿瘤细胞等多种生物学活性, 而对同种属的其他细胞无毒性作用;另一方面, 防御素具有不易诱导机体产生耐药性的特点;因此, 防御素在临床上具有很高的应用价值。目前, 全球滥用抗生素的问题日益严重, 传统抗生素新型菌株的耐药性已经成为医学的一大难题, 所以临床首先要解决的是细菌的耐药性问题, 迄今已经有部分哺乳动物的防御素初步制成药物进行临床应用。防御素在抗肿瘤方面的研究已经成为一大热点, 恶性肿瘤是世界性多发病, 在我国胃癌、肝癌、食管癌、直肠癌等都很常见, 不少患者就诊时已属晚期, 手术治疗非常困难, 而化疗效果有限, 耐药问题突出, 因而开辟新的治疗途径就成为当前的热点。体外试验研究发现, 防御素对多种肿瘤细胞具有杀伤作用, 将防御素引入肿瘤基因治疗的研究领域, 不仅能解决防御素提取和纯化难度大的问题, 同时探讨其在肿瘤基因治疗中的有效性, 对今后在临床上将防御素应用于抗肿瘤治疗具有重要意义。
4 结论
由于防御素分子小、结构稳定, 为当今研制多肽类新药提供了理想的分子设计骨架和模板, 防御素可以调动机体的获得性免疫, 通过机体内β-防御素与趋化因子受体 CCR6的相互作用来募集未成熟的树突状细胞和记忆T淋巴细胞到达有微生物入侵的皮肤和黏膜部位, 利用β-防御素在固有免疫和获得性免疫中的双重作用辅助传统抗生素预防和治疗微生物感染。防御素还可以作为肉类食品保鲜剂, 研究表明, 防御素有可能替代传统化学防腐剂, 不仅可保持肉类食品风味, 不会给人体带来不良反应, 有益于食品安全和人体健康。防御素还可以替代传统治疗性抗生素, 由于传统抗生素有不同程度的残留, 而且会导致耐药菌株的出现, 迫使人们去寻找新型的抗微生物制剂, 以防御素为代表的抗微生物肽类能够快速地杀死病原微生物, 而且对其有抵抗力的细菌不多。因此, 防御素在疾病预防、治疗及食品保鲜方面有着广阔的开发应用前景。
参考文献
[1]AUVYNET C, ROSENSTEIN Y.Multifunctional host defense pep-tides:Antimicrobial peptides, the small yet big players in innateand adaptive immunity[J].FEBS J, 2009, 276 (22) :6497-6508.
[2]冯燕, 李明远.防御素的结构特点及抗肿瘤机制研究进展[J].肿瘤预防与治疗, 2008, 21 (4) :466-469.
[3]EISENHAUER P B, LEHRER R I.Mouse neutrophils lack defe-nsins[J].Infect Immun, 1992, 60 (8) :3446-3447.
[4]PAZGIER M, HOOVER D M, YANG D, et al.Human beta-de-fensins[J].Cell Mol Life Sci, 2006, 63 (11) :1294-1313.
[5]TANAKA T, RAHMAN M M, BATTUR B, et al.Parasiticidal ac-tivity of human alpha-defensin-5 against Toxoplasma gondii[J].In Vitro Cell Dev Biol Anim, 2010, 46 (6) :560-565.
[6]YANG D, BIRAGYN A, HOOVER D M, et al.Multiple roles ofantimicrobial defensins, cathelicidins, and eosinophil-derived neu-ro-toxin in host defense[J].Annu Rev Immunol, 2004, 22:181-215.
[7]HADJICHARALAMBOUS C, SHEYNIS T, JELINEK R, et al.Me-chanisms of alpha-defensin bactericidal action:comparative mem-brane disruption by cryptdin-4 and Its disulfide-null analogue[J].Biochemistry, 2008, 25 (47) :12626-12634.
[8]DAS H, SWAMY N, SAHOO G, et al.Beta-defensin antibioticpeptides in the innate immunity of the buffalo:in vivo and in vitrostudies[J].Altern Lab Anim, 2008, 36 (4) :429-440.
[9]THEVISSEN K, OSBORN R W, ACLAND D P, et al.Specifichigh affinity binding sites for an antifungal plant defensin on Neuros-pora crassa hyphae and microsomal membranes[J].J Biol Chem, 1997, 272 (51) :32176-32181.
[10]HUTTNER K M, BEVINS C L.Antimicrobial peptides as mediatorsof epithelial host defense[J].Pediatr Res, 1999, 45 (6) :785-794.
[11]LEHRER R I.Multispecific myeloid defensins[J].Curr Opin He-matol, 2007, 14 (1) :16-21.
金科新章程 防御野蛮人？ 篇3
然而，叫好之声尚未散去，金科却已开始未雨绸缪。10月17日晚间，金科披露经2016年第四次临时股东大会审议通过的《公司章程》，规定：“董事会成员中应有不少于五分之一的职工代表担任董事，担任董事的职工代表须由在本公司连续工作满五年以上的职工通过职工代表大会民主选举产生后，直接进入董事会。”
有分析称，如果此前同意股权稀释引入融创是资本之策，那如今修改章程就是黄氏为制衡未来潜在股争的应对之举。
筑起防御墙
10月17日，金科地产集团股份有限公司（以下简称“金科”）在重庆总部的会议室，以现场投票和网络投票相结合的方式召开2016年第四次临时股东大会，审议关于减少注册资本的议案，修改《公司章程》的议案，以及修改《公司股东大会议事规则》的议案。
从金科披露的公告看，出席此次股东大会的参会股东及股东代表共计1281名，代表股份17.71亿股，占公司总股份的40.92%。
据记者了解，目前黄红云、陶虹遐夫妇实际持股金科31.44%，新任董事会主席蒋思海持股0.74%。加上股东大会全体董事、监事、高级管理人员基本出席，现场参股的中小股东持股约为5%左右。
即将晋升二股东的融创由于定增股票未过户，因此已排除在此次股东大会之外。而前十大股东之一恒大系，据称并未出现在股东大会现场。
最终，金科股东大会审议的三项议案毫无悬念获得通过，投资者普遍认为这体现了大股东意愿的结果。
新章程引入了“职工代表担任董事”这一全新概念，并规定：“董事会成员中应有不少于五分之一的职工代表担任董事，担任董事的职工代表须由在本公司连续工作满五年以上的职工通过职工代表大会民主选举产生后，直接进入董事会。”
这些新的规定被外界解读为黄红云巩固董事会话语权，制衡孙宏斌而筑起的“防御墙”。
有投资者分析称，金科董事会共9名董事，不少于五分之一即至少2名董事为老职工；引入融创后，黄红云家族及核心高管持股仍超过31%，也至少可以获得2名董事名额。换言之，黄红云及核心高管可占据一半以上席位，可以将董事会的控制权牢牢握在手心。“尽管融创已获金科第二大股东席位，但新章程后，未来孙宏斌难有成为大股东的可能”。
一次必要的抉择
引入融创，却又暗中掣肘，金科的葫芦里卖的什么药？
“其实梳理一下金科近年来的发展历程，再结合当下的市场环境，就不难理解金科的这番动作了。”中投证券分析师李少明表示。
在李战洪（曾任融创集团营销中心总经理）任职金科集团副总裁期间，制定了“622”、“3010”战略，即坚持以二三线城市为主、一四线城市为辅的发展战略，以大重庆为中心的中西部规模开发占比60%，长三角和环渤海地区各占比20%，以及用10年的时间进入中国30个大重庆范围的区县和地级市。
在该战略的指导下，它的年营收稳步上升，但均维持在一两百亿元。年报数据显示，2013年、2014年及2015年，金科地产营业收入分别为160.7亿元、173.24亿元及193.99亿元。
发展初期，对于资金有限的金科而言，城镇化概念驱使下的三四线城市定位或是比较稳妥的选择。但放眼当下，这样的布局，一定程度上也拖累了它的发展步伐。
“李战洪时代的金科退出了主城区，选择深耕重庆30个区县，导致该公司在三四线及二三线城市郊区的存量过大，发展遇到瓶颈。”重庆某研究机构一位资深研究经理表示。
自去年开始，该公司意识到了自身三四线城市的布局出现了问题。今年3月25日，该公司召开了全新品牌战略发布会，宣示正式转型。会上，黄红云重提“未来金科将由区县为主转为聚焦二线中部城市；同时，三年内实现刚需首置、品质改善、高端再改客群结构由7：2：1逐步调整到5：4：1。”
在它2016年的半年报中也表示，未来金科将坚持以“二线热点城市为主，一线和中心三线城市为辅，逐步退出四线城市”的布局导向，重点布局“核心十城”。
然而，如今房地产市场竞争激烈，在全国拿地都十分艰难，遑论“核心十城”，在这种情况下，金科必须引入诸如融创这类企业，以图强强联合，做大做强。
除此之外，由于受累于之前重兵布局在三四线城市的项目，它在房地产方面的营收后劲不足。此前黄红云在接受媒体采访时曾表示，到2020年末，实现千亿收入和千亿估值，就半年报上的131亿元营收来看，要实现这一目标仍有很大挑战，或许正是此次引入融创的原因之一。
黄红云的平衡术
金科需要一个强有力的伙伴，在未来的市场竞争中站得更稳，但融创会只安于做一个投资者吗？
按照此前双方说法，融创看好金科的未来发展前景，此次认购是“一次较好的投资机会”，在未来将为其带来较好的投资回报。孙宏斌显然也十分重视与金科的交易。9月22日，融创就入股金科发布公告，确定认购金科9.07亿股，并报出认购价4.41元，较金科原定认购价3.63元高出21.5%。
不过，此后三个交易日，金科遭遇大量买单，股票涨幅偏离值累计超过20%，被迫于9月27日停牌；9月29日晚间，该公司迅速宣布召开股东大会审议，正式将修改公司章程提上议程。
对于孙宏斌加盟，黄红云内心或许是矛盾的。
融创曾明确表示，入股金科看中的是它的土地资源。但从西安天朗，到绿城、佳兆业、莱蒙等已并购或并购未成功的各种案例来看，其都有一个相似点，融创总是在这些目标企业发展受困时，伸出“援手”。这一次，其仅是看中了金科的土地储备，还是因为嗅到了更大的商机？
孙宏斌进入金科的时间点非常微妙。在金科定增前一个月，52岁的黄红云突然宣布辞去公司董事局主席、董事及董事会专门委员会相关职务，只保留“实际控制人”这重身份。
另外，重庆市市长黄奇帆近日的一番言论，引来业界关注：“从今年开始三年内，重庆市每年将关闭500家房地产公司，3年关掉1500家。” 这间接表示，未来的重庆房地产市场将会出现更多的并购机会，如孙宏斌这样的“猎豹”将会伺机而动。
9月26日晚，孙宏斌以其个人名义再次增持融创股份至53.22%，更加稳固了其个人对于公司的控股权。这似乎是下一步增持金科股份的“先手”。
金科或许也感觉到威胁的存在。9月26日晚，黄红云也选择了通过个人账户，以每股5.40元的价格，增持了金科1193万股股票，占总股本的0.28%。
截至公告日，金科控股股东重庆市金科投资控股（集团）有限责任公司、实际控制人黄红云及陶虹遐合计持有公司股票13.6亿股股份，占公司总股本的31.44%，且未来还将择机增持。
“自成立26年以来，金科一直是以家族企业存在，黄红云夫妇充当了绝对的控制人角色。孙宏斌的入股打破了这种独大的局面。”一位业内人士称，如果此前同意股权稀释引入融创是资本之策，那如今修改章程就是黄氏为制衡未来潜在股争的应对之举。
但也有投资者认为，金科新章程推出的“职工代表”现在既然能成就大股东在董事会的控股权，未来也有可能成为股东博弈中的关键反转力量。
未来之路
事实上，金科眼下最大考验并非来自融创，而是自身的发展问题。
受益于今年火爆的市场行情，它前三季度实现营收212.9亿元，同比大增91.77%；归属上市公司股东净利润8.96亿元，同比增长27.7%。
东方证券分析师竺劲认为，三季度营收增长显著，但营利能力有所下降，且金科这两年的发展并不理想。
记者查阅其半年报发现，主营业务主要有房地产销售、物业管理、酒店经营、新能源、园林及其他行业五个方面，虽然毛利率都在增长，但除了园林及其他行业，其它四个方面的业务毛利率都表现出同比增长下降的趋势，尤其是其之前转型的新能源领域，毛利率同比下降了31.70个百分点。
而它今年对外宣扬最多的是转型，重点转向在社区综合服务和教育投资管理上，分别投资了10亿元，就目前为止，它仍然没有透露出相关的落地细节。
同时，为了寻求利润增长点，黄红云曾频频在能源板块出手，主要方向为风力发电和光伏发电，通过并购和自建的方式加快优质项目布局。
2014年它以自有资金出资20亿元成立新能源子公司并收购新疆华冉东方新能源公司100%股权，而后2015年11月，还设立了预计规模达36亿元的新能源产业基金。
截至2015年底，金科已获得累计40万千瓦风电项目及2万千瓦光伏项目，完成并网发电20万千瓦，投资额近20亿元。但从新能源的转型来看，仍然主要处于投入而不是产出阶段。
同时，近两年，该公司遭遇了强烈的人事动荡，从2014年到2015年，共有五位高管离职，分别为集团副总裁李战洪、公司董事李宇航、副总裁宗书声、副总裁陈昌凤、副总裁罗伟。
人防御素 篇4
目的:获得大量重组人α防御素(HDα)并检测其活性,为其深入研究提供必要的材料.方法:体外化学合成得到带有羟氨裂解位点编码序列的HDα基因片段,克隆入pBV220-IL-4表达载体构建重组表达载体pBV220-IL-4- HDα.测序正确后将重组质粒转入大肠杆菌DH5α中进行温度诱导表达.经羟氨裂解去除IL-4后,对所得蛋白进行纯化、复性,以SDS-PAGE和生物学活性检测鉴定其特性.结果:经温度诱导后,融合蛋白主要以包涵体的形式表达,表达产物约占菌体总蛋白的20%;羟氨裂解切除IL-4后,所得目的蛋白的纯度约为99.8%.抑菌活性试验和克隆形成试验显示,所得HDα对细菌生长有明显的`抑制作用.结论:成功地构建了HDα基因的重组表达质粒,获得稳定表达的工程菌,并建立了复性与纯化技术,为进一步对其进行功能研究与应用奠定了基础.
作 者：傅海燕 张剑 路凡 蒲勤 王孝功 卢兹凡 徐俊卿 赵忠良 FU Hai-yan ZHANG Jian LU Fan PU Qin WANG Xiao-gong LU Zi-fan XU Jun-qing ZHAO Zhong-liang 作者单位：傅海燕,张剑,路凡,蒲勤,王孝功,卢兹凡,赵忠良,FU Hai-yan,ZHANG Jian,LU Fan,PU Qin,WANG Xiao-gong,LU Zi-fan,ZHAO Zhong-liang(第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室,陕西,西安,710032)
徐俊卿,XU Jun-qing(第四军医大学西京医院放射科,陕西,西安,710032)
人防御素 篇5
1 β-防御素SNPs与疾病的关系
人β-防御素 (human beta-defensin, HBD) 主要有4种, 分别由DEFB1、DEFB4、DEFB103、DEFB104基因编码, 在很多器官的上皮细胞中表达。HBD-1在许多部位呈结构性表达, 炎症可诱导其表达。HBD-2、3在促炎症因子———包括白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 、干扰素 (IFN-γ) 及微生物等的刺激下表达, 呈诱导性表达。目前对DEFB1基因SNP与疾病的相关性研究较多。
单核苷酸多态性标记 (single nucleotide polymorphisms, SNPs) 在动物基因组中出现的频率非常高, 在人类基因组中平均每500~1 000个碱基对中就有一个SNP, 估计其总数在300万个以上[6]。SNP广泛存在于基因的CDS (编码区) 、5’-UTR (非编码区) 、3’-UTR。对于CDS区域SNP (cSNP) 可以产生两种效应———不引起氨基酸替换的同义突变和引起氨基酸替换的非同义突变。非同义突变SNP对基因的结构和功能产生影响, 但这类SNP的突变频率低于同义突变。基因5’-UTR的SNP主要是影响转录因子与启动子的结合能力从而调控基因的转录。最近研究表明miRNA可通过识别靶基因序列的3’-UTR调控约30%的人类基因, 基因mRNA的SNP将影响miRNA对靶基因的调控, 并最终影响基因的生物学功能[7]。因此, 基因5’-UTR、3’-UTR序列变异可能与基因的表达水平相关[8,9], 影响基因的生物学功能。
DEFB1基因存在多个SNP位点, 包括5’-UTR的-52G/A、g-44C/G (rsl800972) 、g-20G/A (rs11362) , CDS的非同义突变G1654A (Val→Ile) , CDS的同义突变C1623T、C1642T, 3’-UTR的692A/G (rs1800971) 等[10]。DEFB1基因的-44C/G位点的上、下游序列分别毗邻CCAAT/增强子结合蛋白-β (C EBPβ) 和NF-κB等转录因子结合位点[11], 并且-44C的存在使NF-κB转录因子结合位点发生改变[12]。NF-κB转录结合位点则是诱导性防御素表达的诱导因子结合区, -44C/G可影响DEFB1基因的转录水平[13]。目前研究也发现-44C/G位点多态性与多种疾病相关。如瘤型麻风[12] (lepromatous leprosy) 、克罗恩病[14] (CD) 、HIV病毒的感染[15,16]、慢性阻塞性肺病[17]、哮喘[18]、特异性皮炎[19]等多种疾病的易感性、严重程度以及预后存在相关性。此外, 该SNP位点也影响绿脓杆菌 (Pseudomonas aeruginosa) 在囊性纤维化 (cystic fibrosis, CF) 病人中的定植[20], 但这种关联性在意大利东北部的CF发病群体中未得到证实[21], 这可能与种族差异有关。
2 β-防御素CNVs (拷贝数变异) 与疾病的关系
基因拷贝数变异 (Copy number variations, CNVs) 是指相对于参照基因组, DNA片段缺失或复制大于1kb至Mb的结构变异[5,22], 主要包括缺失 (Deletions) 、嵌入 (Insertions) 、复制 (Duplications) 和复合多位点变异 (Complex multisite variants) 。CNVs通过扰乱基因活性和改变基因剂量来影响基因表达、表型差异和表型适应, 从而引起疾病[23]。
CNVs是基因组重要的结构变异形式, 研究发现结构变异在某些种类的基因, 尤其是参与分子间和环境间相互作用的基因中明显富集。这类基因或参与机体对细菌感染和外界刺激的防御反应、或参与药物代谢、或调节细胞结构和生物合成、或负责感官知觉, 都富含结构变异区[24,25]。β-防御素正是这类基因, 其不仅具有广泛的抗菌谱, 对机体的先天免疫和获得性免疫反应都起重要作用[1]。研究发现, 人β-防御素基因簇位于染色体8p23.1, DEFB4、DEFB103、DEFB104基因都存在CNVs[26], 并且其CNVs多态性将高于SNPs[27]。CD是IBD的一个主要类型, 表现为胃肠道的慢性、反复发作性和非特异性的全肠壁炎。宿主肠粘膜防御反应与微生物 (尤其是共栖菌群) 之间的动态平衡在IBD的发生和发展中可能起关键性的作用, 肠上皮细胞的抗菌肽如防御素与cathelicidins对肠粘膜免疫起重要作用。hBD-2、hBD-3表达水平的降低导致肠道屏障功能减弱和肠道菌群的改变。克罗恩病可能是一种防御素缺陷综合症, 主要表现为h BD-2、hBD-3的缺乏[28]。DEFB4基因CNVs与其mRNA表达水平呈正相关, 可能导致防御素表达缺陷[26]。Fellermarm.K等人分析了全基因组DEFB-2DNA的拷贝数, 结果表明hBD-2表达较低的健康人比表达正常的人群有较高的风险罹患结肠CD, 并且DEFB4DNA的拷贝数和mRNA表达相关[29]。较低的β-防御素家族基因DNA拷贝数增加了CD的易感性[30], 也与牛皮癣 (Psoriasis) [31]、前列腺癌症 (sporadic prostate cancer) [32]的易感性相关。
3 畜禽β-防御素SNP与抗病选育
虽然β-防御素广泛存在于猪、牛、羊、兔、家禽等畜禽中, 并且对畜禽的先天免疫功能起重要作用[4]。但是, 目前关于畜禽β-防御素SNP与疾病的研究仅见于牛和鸡。牛β-防御素-42239C>T位点与牛奶的乳脂、乳蛋白、乳糖及体细胞数量相关[33]。
沙门氏菌是一种可通过食物传播的细菌性病原体, 其对动物和人类健康有极大的危害。通过对与沙门氏菌反应特性的相关候选基因研究, 有利于加速对沙门氏菌定植有抗性的家禽品种或品系的选育。目前, 已有许多影响宿主细胞对肠炎血清型肠道沙门氏菌 (Salmonella enterica serovar Enteri-tidis) 反应的候选基因被研究, 如组织相容性复合物 (MHC-Ⅰ、Ⅱ) [34]。通过分析AvBD (家禽β-防御素) 2、3、4、5、7基因的SNP与接种肠炎血清型肠道沙门氏菌疫苗后抗体水平的相关性发现, AvBD-3、7的SNPs将可作为分子标记应用于对肠炎血清型肠道沙门氏菌敏感鸡群的鉴定[35]。AvBD-11、AvBD-12和AvBD-13这三个相邻基因的SNP位点共同构成6种对盲肠沙门氏菌定植有较高抵抗的单倍型, 其中以TGA单倍型对沙门氏菌抵抗最高[36]。此外, Sadeyen等[37,38]研究表明, 对沙门氏菌抵抗的61家系雏鸡、蛋鸡经口腔感染沙门氏菌后AvBD-1、2mRNA表达水平高与易感家系15I, 并且脾脏中沙门氏菌的清除速度较快。对于在不同抗性家系中AvBD-1、2mRNA表达水平调控差异目前尚未见报道, 是否SNPs或CNVs与其表达水平间存在关系有待进一步研究。
5 展望