U937

U937 篇1

热休克蛋白(heat shock protein,HSP)家族有多个成员,具有分子伴侣功能,能调节蛋白质的折叠、传递和降解,与细胞凋亡有着密切的联系。目前对HSP90的研究越来越受到重视。但是,关于HSP90在金葡菌诱导的U937凋亡过程中的作用尚未见报道。因此,我们设计实验,探讨HSP90表达与该凋亡过程的关系。

1 材料与方法

1.1 试剂

Monoclonal anti-β-actin antibodies抗体购自Santa Cruz生物技术公司(Santa Cruz,CA,USA),HSP90抗体购自Upstate公司(Charlottesvile,VA),An annexin V apoptosis凋亡试剂盒为RD公司产品;细胞培养试剂购自Invitrogen公司;其它所有试剂均购自Sigma公司(St.Lowis,MO)。

1.2 方法

1.2.1 准备细菌

金葡菌菌株Wood46由中山大学生命科学学院提供,根据文献[2]进行培养,用不含抗生素的含5%小牛血清的RPMI 1640培养基重悬并稀释。

1.2.2 细胞分离培养

人巨噬细胞系U937在含10%小牛血清、2 m M L-谷氨酸钠、100 U/mL青霉素和100 g/m L链霉素的RPMI 1640培养基中,于37℃、5%CO2的培养箱中培养。

1.2.3 金葡菌诱导U937凋亡

U937与金葡菌分别以0,1∶5,1∶10,1∶20,1∶50和1∶100的比例在37℃水浴培养30 min或当细胞:细菌为1∶20时分别培养0,15,30,60和90 min。然后离心2次(220g,8 min),洗去未吞噬细菌,置于含10%小牛血清、2倍青霉素及链霉素的RPMI 1640培养基中培养3h,获得感染的U937细胞。在一些实验中,金葡菌在60℃灭活30 min。

1.2.4 Annexin V FITC/PI双染分析

U937细胞的凋亡率用流式细胞仪检测。106细胞加入含有annexin V的60μL结合缓冲液,4℃避光15 min。为了区别早期凋亡和晚期凋亡或坏死细胞,细胞在检测前同时染annexin V和PI。细胞结合annexin V-FITC和PI后其结果采用CellQuest软件用流式细胞仪进行分析(FACS Calibur,BD Biosciences)。每个样品至少计数10 000个细胞。

1.2.5 Western blot

细菌感染细胞后用冰冷的PBS洗1次。包括1 m M Na2VO4和溶解缓冲液(50 m M Tris,pH 8.0,150 m M NaCl,5 m M EDTA,5%Glycerol,1%Triton X-100,25 m M NaF,2 m M Na2VO4,10μg/m L的各种抑肽酶、亮肽素和抑肽素)。细胞溶解产物被冰冻和融化3次,然后在4℃、14 000 g离心10 min。提取的细胞上清用DC蛋白分析试剂盒,用Lowry法测定总蛋白浓度(Bio-Rad,Hercules,CA)。按每孔加总蛋白50μg,进行SDS-PAGE凝胶电泳后,电转移至硝酸纤维素滤膜上(PVDF膜)。膜在包括0.05%Tween-20(TBST)的三羟甲基氨基甲烷缓冲液中用5%的脱脂奶封闭,然后加入兔抗人HSP90,4℃孵育过夜。应用β-Actin(1∶2 000)使蛋白量保持一致。然后用TBS-T缓冲液洗3次,加入辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG(Santa Cruz,CA),然后用化学发光法显色(PIERCE,Rockford,IL)。将滤膜用凝胶成像分析系统进行扫描,读取各条带的吸光度A值。

1.3 统计学分析

SPSS 10.0统计学软件进行统计学处理,凋亡率用均数±标准差统计。多组间均数比较采用单因素方差分析,组间两两比较用最小显著差法。当P<0.05时被认为具有统计学意义。每组实验均重复3次。

2 结果

2.1 金葡菌对U 937细胞凋亡的影响

U937细胞感染金葡菌后发生凋亡,并且凋亡百分率随着金葡菌浓度的增加及感染时间的延长而升高。1∶20,1∶50和1∶100组以及30,60和90 min组的细胞凋亡指数明显高于对照组(P<0.001),见图1。

2.2 金葡菌感染时H S P 90表达水平

我们用Western blot法检测了金葡菌感染是否通过HSP90通路。结果清楚地表明:HSP90的表达随着金葡菌浓度的增加及感染时间的延长而逐渐升高,见图2,图3。

3 讨论

高温、缺血和缺氧、化学毒物以及细菌或病毒感染等应激因子可以诱导细胞合成热应激蛋白,以适应或耐受不利的应激环境[3],故这类反应也被称为应激反应,热休克蛋白也被称为应激蛋白。热休克蛋白在应激条件下具有细胞保护作用[4]。热休克蛋白有多个家族,按其分子量大小主要分为HSP90、HSP70、HSP60和小HSP[5]。HSP90是一种分子伴侣,在保护蛋白质的正确空间结构、防止其意外降解和保护蛋白质功能方面有重要意义。HSP90的主要作用是结合已获得3级结构的蛋白质,参与这些蛋白质的激活与成熟过程[6]。研究表明,HSP家族是除Bcl-2之外的另一类抗凋亡基因家族。有关HSP90与凋亡的关系越来越受到重视。但是,关于HSP90在感染诱导的细胞凋亡过程中的作用,目前研究甚少。

许多病原体能够诱导细胞凋亡,包括大肠杆菌、金葡菌及结核杆菌等[7,8,9]。我们过去的研究发现:丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)信号转导通路中的三个成员P38MAPK,JNK和ERK在金葡菌诱导的U937细胞凋亡过程中起到了重要的作用[10]。在本研究中,我们应用金葡菌感染所致的凋亡U937细胞作为研究模型,探讨HSP90在这一过程中的作用。结果表明:U937细胞的凋亡率随着金葡菌浓度及感染时间的增加而逐渐升高,HSP90的表达随着金葡菌浓度及感染时间的增加而逐渐升高。

不同的细菌可能通过不同的信号转导通路诱导细胞凋亡,并且细胞凋亡信号转导途径的启动受细胞的来源、种类及生长环境等多种因素影响。关于金葡菌诱导U937细胞凋亡信号转导通路中的详细机理有待于进一步研究。HSP90表达与金葡菌所致的U937细胞凋亡的关系对于进一步认识金葡菌的致病机制及开发新型抗感染药物均具有一定的意义。我们以后的研究将进一步探讨在金葡菌诱导U937细胞凋亡过程中是否有其它信号转导通路的参与以及HSP90与这些信号转导系统之间的关系。

参考文献

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[3]ERLICHMAN C.Tanespimycin:the opportunities and challenges of targeting heat shock protein90[J].Expert Opin Investig Drugs,2009,18(6):861-868.

[4]NAKAJIMA M,KATO H,MIYAZAKI T,et al.Tumor immune systems in Esophageal cancer with special reference to heat-shock protein70and humoral immunity[J].Anticancer Res,2009,29(5):1595-1606.

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U937 篇2

用氧化修饰低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导人髓系白血病细胞株U937细胞凋亡,并研究其作用机制.用脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP切口末端标记技术(TUNEL法)、流式细胞仪和DNA断裂分析检测细胞凋亡;用免疫组化检测c-fos、c-jun和c-myc蛋白表达,RT-PCR显示c-fos、c-jun和c-myc mRNA表达水平.结果表明ox-LDL可致U937细胞凋亡,其作用具有浓度效应;ox-LDL可以上调c-fos、c-jun和c-myc基因表达,使c-fos、c-jun和c-myc蛋白合成增多,最终诱导U937细胞凋亡.

作 者：杨向东 杨永宗 黎健 YANG Xiang-Dong YANG Yong-Zong LI Jian 作者单位：杨向东,杨永宗,YANG Xiang-Dong,YANG Yong-Zong(衡阳医学院心血管病研究所,衡阳,421001)

黎健,LI Jian(卫生部北京老年医学研究所,北京,100730)